Ang differential diagnosis sa mga pulmonary nodules nga nailhan pinaagi sa computed tomography (CT) nagpabilin nga usa ka hagit sa klinikal nga praktis. Dinhi, among gihulagway ang global metabolome sa 480 ka serum samples, lakip ang himsog nga mga kontrol, benign lung nodules, ug stage I lung adenocarcinoma. Ang mga adenocarcinoma nagpakita og talagsaon nga metabolomic profiles, samtang ang benign nodules ug himsog nga mga indibidwal adunay taas nga pagkaparehas sa metabolomic profiles. Sa discovery group (n = 306), usa ka set sa 27 ka metabolites ang nailhan aron mailhan ang benign ug malignant nodules. Ang AUC sa discriminant model sa internal validation (n = 104) ug external validation (n = 111) nga mga grupo kay 0.915 ug 0.945, matag usa. Ang pathway analysis nagpadayag sa pagtaas sa glycolytic metabolites nga nalangkit sa pagkunhod sa tryptophan sa lung adenocarcinoma serum kon itandi sa benign nodules ug himsog nga mga kontrol, ug nagsugyot nga ang tryptophan uptake nagpasiugda sa glycolysis sa mga selula sa kanser sa baga. Ang among pagtuon nagpasiugda sa bili sa serum metabolite biomarkers sa pagtimbang-timbang sa risgo sa pulmonary nodules nga nakita sa CT.
Ang sayo nga pagdayagnos hinungdanon aron mapauswag ang survival rate sa mga pasyente sa kanser. Ang mga resulta gikan sa US National Lung Cancer Screening Trial (NLST) ug sa European NELSON Study nagpakita nga ang screening gamit ang low-dose computed tomography (LDCT) makapakunhod pag-ayo sa mortality rate sa kanser sa baga sa mga high-risk nga grupo1,2,3. Sukad sa kaylap nga paggamit sa LDCT para sa screening sa kanser sa baga, ang insidente sa incidental radiographic findings sa asymptomatic pulmonary nodules nagpadayon sa pagsaka4. Ang pulmonary nodules gihubit nga focal opacities hangtod sa 3 cm ang diametro5. Nag-atubang kami og mga kalisud sa pagtimbang-timbang sa posibilidad sa malignancy ug pag-atubang sa daghang gidaghanon sa pulmonary nodules nga nakit-an nga aksidente sa LDCT. Ang mga limitasyon sa CT mahimong mosangpot sa kanunay nga follow-up nga mga eksaminasyon ug false-positive nga mga resulta, nga mosangpot sa wala kinahanglana nga interbensyon ug sobra nga pagtambal6. Busa, adunay panginahanglan sa paghimo og kasaligan ug mapuslanon nga mga biomarker aron husto nga mailhan ang kanser sa baga sa sayo nga mga yugto ug mailhan ang kadaghanan sa mga benign nodules sa inisyal nga pagdayagnos7.
Ang komprehensibo nga molekular nga pag-analisa sa dugo (serum, plasma, peripheral blood mononuclear cells), lakip ang genomics, proteomics o DNA methylation8,9,10, misangpot sa nagkadako nga interes sa pagdiskobre sa mga diagnostic biomarker para sa kanser sa baga. Samtang, ang mga pamaagi sa metabolomics nagsukod sa mga produkto sa cellular nga naimpluwensyahan sa endogenous ug exogenous nga mga aksyon ug busa gigamit aron matagna ang pagsugod ug resulta sa sakit. Ang Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS) usa ka kaylap nga gigamit nga pamaagi para sa mga pagtuon sa metabolomics tungod sa taas nga sensitivity ug dako nga dynamic range, nga makatabon sa mga metabolite nga adunay lain-laing physicochemical properties11,12,13. Bisan tuod ang global metabolomic analysis sa plasma/serum gigamit aron mailhan ang mga biomarker nga nalangkit sa diagnosis sa kanser sa baga14,15,16,17 ug ang kaepektibo sa pagtambal,18 ang mga serum metabolite classifier aron mailhan ang benign ug malignant nga mga nodule sa baga nagpabilin nga daghan nga gitun-an. -dakong panukiduki.
Ang adenocarcinoma ug squamous cell carcinoma mao ang duha ka pangunang subtype sa non-small cell lung cancer (NSCLC). Ang lain-laing mga CT screening test nagpakita nga ang adenocarcinoma mao ang labing komon nga histological nga tipo sa kanser sa baga1,19,20,21. Niini nga pagtuon, migamit kami og ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) aron paghimo og metabolomics analysis sa kinatibuk-an nga 695 ka serum samples, lakip ang himsog nga mga kontrol, benign pulmonary nodules, ug CT-detected ≤3 cm. Screening para sa Stage I lung adenocarcinoma. Nakaila kami og usa ka panel sa serum metabolites nga nagpalahi sa lung adenocarcinoma gikan sa benign nodules ug himsog nga mga kontrol. Ang pathway enrichment analysis nagpadayag nga ang abnormal nga tryptophan ug glucose metabolism mga komon nga pagbag-o sa lung adenocarcinoma kon itandi sa benign nodules ug himsog nga mga kontrol. Sa katapusan, nagtukod ug nag-validate kami og serum metabolic classifier nga adunay taas nga specificity ug sensitivity aron mailhan ang malignant ug benign pulmonary nodules nga nakita sa LDCT, nga makatabang sa sayo nga differential diagnosis ug risk assessment.
Sa kasamtangang pagtuon, ang mga sample sa serum nga gipares sa sekso ug edad gikolekta gikan sa 174 ka himsog nga mga kontrol, 292 ka mga pasyente nga adunay benign pulmonary nodules, ug 229 ka mga pasyente nga adunay stage I lung adenocarcinoma. Ang mga demograpikong kinaiya sa 695 ka mga hilisgutan gipakita sa Supplementary Table 1.
Sama sa gipakita sa Figure 1a, usa ka total nga 480 ka serum samples, lakip ang 174 ka healthy control (HC), 170 ka benign nodules (BN), ug 136 ka stage I lung adenocarcinoma (LA) samples, ang gikolekta sa Sun Yat-sen University Cancer Center. Discovery cohort para sa untargeted metabolomic profiling gamit ang ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS). Sama sa gipakita sa Supplementary Figure 1, ang differential metabolites tali sa LA ug HC, LA ug BN giila aron matukod ang classification model ug masusi pa ang differential pathway analysis. 104 ka samples nga gikolekta sa Sun Yat-sen University Cancer Center ug 111 ka samples nga gikolekta sa duha pa ka ospital ang gipailalom sa internal ug external validation, matag usa.
a Populasyon sa pagtuon sa discovery cohort nga gipailalom sa global serum metabolomics analysis gamit ang ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS). b Partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) sa kinatibuk-ang metabolome sa 480 ka serum samples gikan sa study cohort, lakip ang himsog nga mga kontrol (HC, n = 174), benign nodules (BN, n = 170), ug stage I lung adenocarcinoma (Los Angeles, n = 136). +ESI, positive electrospray ionization mode, -ESI, negative electrospray ionization mode. c–e Ang mga metabolite nga adunay managlahi nga kadaghanon sa duha ka gihatag nga grupo (two-tailed Wilcoxon signed rank test, false discovery rate adjusted p value, FDR <0.05) gipakita sa pula (fold change > 1.2) ug asul (fold change < 0.83). ) gipakita sa volcano graphic. f Hierarchical clustering heat map nga nagpakita sa mga dakong kalainan sa gidaghanon sa mga annotated metabolites tali sa LA ug BN. Ang source data gihatag sa porma sa source data files.
Ang total serum metabolome sa 174 HC, 170 BN ug 136 LA sa discovery group gisusi gamit ang UPLC-HRMS analysis. Una namong gipakita nga ang mga sample sa quality control (QC) hugot nga nagtapok sa sentro sa usa ka unsupervised principal component analysis (PCA) model, nga nagpamatuod sa kalig-on sa performance sa kasamtangang pagtuon (Supplementary Figure 2).
Sama sa gipakita sa partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) sa Figure 1 b, among nakita nga adunay klaro nga mga kalainan tali sa LA ug BN, LA ug HC sa positibo (+ESI) ug negatibo (−ESI) electrospray ionization modes. Bisan pa, walay nakit-an nga hinungdanon nga mga kalainan tali sa BN ug HC sa mga kondisyon sa +ESI ug -ESI.
Nakakita mig 382 ka differential features tali sa LA ug HC, 231 ka differential features tali sa LA ug BN, ug 95 ka differential features tali sa BN ug HC (Wilcoxon signed rank test, FDR <0.05 ug multiple change >1.2 o <0.83) (Figure .1c-e). Ang mga peak gidugangan og annotation (Supplementary Data 3) batok sa database (mzCloud/HMDB/Chemspider library) pinaagi sa m/z value, retention time ug fragmentation mass spectrum search (mga detalye nga gihulagway sa Methods section) 22. Sa katapusan, 33 ug 38 ka annotated metabolites nga adunay significant differences sa abundance ang giila para sa LA versus BN (Figure 1f ug Supplementary Table 2) ug LA versus HC (Supplementary Figure 3 ug Supplementary Table 2), matag usa. Sa kasukwahi, 3 lang ka metabolites nga adunay significant differences sa abundance ang giila sa BN ug HC (Supplementary Table 2), nga nahiuyon sa overlap tali sa BN ug HC sa PLS-DA. Kining mga differential metabolites naglangkob sa lain-laing mga biochemical (Supplementary Figure 4). Kon tan-awon sa kinatibuk-an, kining mga resulta nagpakita sa mga mahinungdanong pagbag-o sa serum metabolome nga nagpakita sa malignant transformation sa early-stage lung cancer kon itandi sa benign lung nodules o himsog nga mga subject. Samtang, ang pagkaparehas sa serum metabolome sa BN ug HC nagsugyot nga ang benign pulmonary nodules mahimong adunay daghang biological nga mga kinaiya sa himsog nga mga indibidwal. Tungod kay ang epidermal growth factor receptor (EGFR) gene mutations komon sa lung adenocarcinoma subtype 23, among gitinguha nga mahibal-an ang epekto sa driver mutations sa serum metabolome. Dayon among gisusi ang kinatibuk-ang metabolomic profile sa 72 ka mga kaso nga adunay EGFR status sa lung adenocarcinoma group. Makapainteres, nakakita kami og parehas nga mga profile tali sa mga pasyente nga adunay EGFR mutant (n = 41) ug mga pasyente nga adunay EGFR wild-type (n = 31) sa PCA analysis (Supplementary Figure 5a). Apan, among nakita ang 7 ka metabolite kansang kadagaya nausab pag-ayo sa mga pasyente nga adunay EGFR mutation kon itandi sa mga pasyente nga adunay wild-type EGFR (t test, p < 0.05 ug fold change > 1.2 o < 0.83) (Supplementary Figure 5b). Kadaghanan niining mga metabolite (5 sa 7) kay acylcarnitines, nga adunay importanteng papel sa fatty acid oxidation pathways.
Sama sa gipakita sa workflow nga gipakita sa Figure 2 a, ang mga biomarker para sa nodule classification nakuha gamit ang least absolute shrinkage operators ug selection base sa 33 ka differential metabolites nga giila sa LA (n = 136) ug BN (n = 170). Best combination of variables (LASSO) – binary logistic regression model. Gigamit ang ten-fold cross-validation aron masulayan ang kasaligan sa modelo. Ang variable selection ug parameter regularization gi-adjust pinaagi sa likelihood maximization penalty nga adunay parameter nga λ24. Ang global metabolomics analysis gihimo usab nga independente sa internal validation (n = 104) ug external validation (n = 111) nga mga grupo aron masulayan ang classification performance sa discriminant model. Tungod niini, 27 ka metabolites sa discovery set ang giila nga pinakamaayong discriminant model nga adunay pinakadako nga mean AUC value (Fig. 2b), diin 9 ang adunay dugang nga kalihokan ug 18 ang mikunhod nga kalihokan sa LA kon itandi sa BN (Fig. 2c).
Workflow para sa paghimo og pulmonary nodule classifier, lakip ang pagpili sa pinakamaayong panel sa serum metabolites sa discovery set gamit ang binary logistic regression model pinaagi sa ten-fold cross-validation ug pag-evaluate sa predictive performance sa internal ug external validation sets. b Cross-validation statistics sa LASSO regression model para sa metabolic biomarker selection. Ang mga numero nga gihatag sa ibabaw nagrepresentar sa average nga gidaghanon sa mga biomarker nga gipili sa usa ka gihatag nga λ. Ang pula nga tuldok-tuldok nga linya nagrepresentar sa average nga kantidad sa AUC sa katugbang nga lambda. Ang gray error bars nagrepresentar sa minimum ug maximum nga kantidad sa AUC. Ang tuldok-tuldok nga linya nagpakita sa pinakamaayong modelo nga adunay 27 ka pinili nga biomarker. AUC, area ubos sa receiver operating characteristic (ROC) curve. c Fold changes sa 27 ka pinili nga metabolites sa LA group kon itandi sa BN group sa discovery group. Pula nga kolum – activation. Ang asul nga kolum usa ka decline. d–f Receiver operating characteristic (ROC) curves nga nagpakita sa gahum sa discriminant model base sa 27 ka metabolite combinations sa discovery, internal, ug external validation sets. Ang source data gihatag sa porma sa source data files.
Usa ka prediction model ang gihimo base sa weighted regression coefficients niining 27 ka metabolites (Supplementary Table 3). Ang ROC analysis base niining 27 ka metabolites nakahatag og area under the curve (AUC) value nga 0.933, discovery group sensitivity kay 0.868, ug specificity kay 0.859 (Fig. 2d). Samtang, taliwala sa 38 ka annotated differential metabolites tali sa LA ug HC, usa ka set sa 16 ka metabolites ang nakab-ot og AUC nga 0.902 nga adunay sensitivity nga 0.801 ug specificity nga 0.856 sa pag-ila sa LA gikan sa HC (Supplementary Figure 6a-c). Ang mga AUC values nga gibase sa lain-laing fold change thresholds para sa differential metabolites gitandi usab. Among nakita nga ang classification model labing maayo nga mi-perform sa pag-ila tali sa LA ug BN (HC) sa dihang ang fold change level gibutang sa 1.2 batok sa 1.5 o 2.0 (Supplementary Figure 7a,b). Ang modelo sa klasipikasyon, base sa 27 ka grupo sa metabolite, dugang nga gi-validate sa internal ug external cohort. Ang AUC kay 0.915 (sensitivity 0.867, specificity 0.811) para sa internal validation ug 0.945 (sensitivity 0.810, specificity 0.979) para sa external validation (Fig. 2e, f). Aron masusi ang interlaboratory efficiency, 40 ka sample gikan sa external cohort ang gi-analisa sa usa ka external laboratory sama sa gihulagway sa Methods section. Ang katukma sa klasipikasyon nakab-ot ang AUC nga 0.925 (Supplementary Figure 8). Tungod kay ang lung squamous cell carcinoma (LUSC) mao ang ikaduha nga labing komon nga subtype sa non-small cell lung cancer (NSCLC) sunod sa lung adenocarcinoma (LUAD), among gisulayan usab ang validated potential utility sa metabolic profiles. BN ug 16 ka kaso sa LUSC. Ang AUC sa discrimination tali sa LUSC ug BN kay 0.776 (Supplementary Figure 9), nga nagpakita sa mas ubos nga abilidad kon itandi sa discrimination tali sa LUAD ug BN.
Gipakita sa mga pagtuon nga ang gidak-on sa mga nodule sa mga imahe sa CT positibo nga may kalabutan sa posibilidad sa kanser ug nagpabilin nga usa ka mayor nga determinant sa pagtambal sa nodule25,26,27. Ang pag-analisar sa datos gikan sa dako nga cohort sa pagtuon sa screening sa NELSON nagpakita nga ang risgo sa kanser sa mga subject nga adunay mga node nga <5 mm parehas pa gani sa mga subject nga walay mga node28. Busa, ang minimum nga gidak-on nga nanginahanglan og regular nga pagmonitor sa CT mao ang 5 mm, sama sa girekomenda sa British Thoracic Society (BTS), ug 6 mm, sama sa girekomenda sa Fleischner Society29. Bisan pa, ang mga nodule nga mas dako sa 6 mm ug walay klaro nga benign features, nga gitawag og indeterminate pulmonary nodules (IPN), nagpabilin nga usa ka mayor nga hagit sa ebalwasyon ug pagdumala sa klinikal nga praktis30,31. Sunod namong gisusi kung ang gidak-on sa nodule nakaimpluwensya ba sa mga metabolomic signature gamit ang pooled samples gikan sa discovery ug internal validation cohorts. Nag-focus sa 27 ka validated biomarkers, una namong gitandi ang mga profile sa PCA sa HC ug BN sub-6 mm metabolomes. Among nakita nga kadaghanan sa mga data point para sa HC ug BN nagsapaw, nga nagpakita nga ang serum metabolite levels parehas sa duha ka grupo (Fig. 3a). Ang feature maps sa lain-laing gidak-on nagpabilin nga nakonserba sa BN ug LA (Fig. 3b, c), samtang ang panagbulag naobserbahan tali sa malignant ug benign nodules sa 6–20 mm range (Fig. 3d). Kini nga cohort adunay AUC nga 0.927, specificity nga 0.868, ug sensitivity nga 0.820 para sa pagtagna sa malignancy sa mga nodules nga may sukod nga 6 ngadto sa 20 mm (Fig. 3e, f). Ang among mga resulta nagpakita nga ang classifier makadakop sa mga pagbag-o sa metabolismo nga gipahinabo sa sayo nga malignant transformation, bisan unsa pa ang gidak-on sa nodule.
ad Pagtandi sa mga profile sa PCA tali sa gitakdang mga grupo base sa usa ka metabolic classifier nga 27 ka metabolite. CC ug BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. sa LA 6–20 mm batok sa LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm ug LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Receiver operating characteristic (ROC) curve nga nagpakita sa discriminant model performance para sa mga nodule 6–20 mm. f Ang mga kantidad sa probabilidad gikalkulo base sa logistic regression model para sa mga nodule nga may sukod nga 6–20 mm. Ang gray dotted line nagrepresentar sa optimal cutoff value (0.455). Ang mga numero sa ibabaw nagrepresentar sa porsyento sa mga kaso nga giplano para sa Los Angeles. Gamita ang two-tailed Student's t test. PCA, pag-analisa sa pangunang sangkap. AUC area ubos sa kurba. Ang tinubdan nga datos gihatag sa porma sa mga file sa tinubdan nga datos.
Upat ka mga sample (nag-edad og 44–61 ka tuig) nga adunay parehas nga gidak-on sa pulmonary nodule (7–9 mm) ang gipili aron ipakita ang performance sa gisugyot nga malignancy prediction model (Fig. 4a, b). Sa inisyal nga screening, ang Case 1 nagpakita isip usa ka solid nodule nga adunay calcification, usa ka feature nga nalangkit sa benignity, samtang ang Case 2 nagpakita isip usa ka indeterminate partially solid nodule nga walay klaro nga benign features. Tulo ka rounds sa follow-up CT scans nagpakita nga kini nga mga kaso nagpabilin nga lig-on sulod sa 4 ka tuig nga panahon ug busa giisip nga benign nodules (Fig. 4a). Kung itandi sa clinical evaluation sa serial CT scans, ang single-shot serum metabolite analysis gamit ang kasamtangang classifier model dali ug husto nga nakaila niining mga benign nodules base sa probabilistic constraints (Table 1). Ang Figure 4b sa case 3 nagpakita sa usa ka nodule nga adunay mga timailhan sa pleural retraction, nga kasagaran nalangkit sa malignancy32. Ang Case 4 nagpakita isip usa ka indeterminate partially solid nodule nga walay ebidensya sa usa ka benign nga hinungdan. Kining tanan nga mga kaso gitagna nga malignant sumala sa classifier model (Table 1). Ang pagtimbang-timbang sa lung adenocarcinoma gipakita pinaagi sa histopathological examination human sa lung resection surgery (Fig. 4b). Alang sa external validation set, ang metabolic classifier tukmang nagtagna og duha ka kaso sa indeterminate lung nodules nga mas dako pa sa 6 mm (Supplementary Figure 10).
Mga CT image sa axial window sa baga sa duha ka kaso sa benign nodules. Sa kaso 1, ang CT scan human sa 4 ka tuig nagpakita og lig-on nga solid nodule nga may sukod nga 7 mm nga adunay calcification sa tuo nga ubos nga lobe. Sa kaso 2, ang CT scan human sa 5 ka tuig nagpakita og lig-on, partially solid nodule nga may diametro nga 7 mm sa tuo nga ibabaw nga lobe. b Axial window CT images sa baga ug katugbang nga pathological studies sa duha ka kaso sa stage I adenocarcinoma sa wala pa ang lung resection. Ang kaso 3 nagpakita og nodule nga may diametro nga 8 mm sa tuo nga ibabaw nga lobe nga may pleural retraction. Ang kaso 4 nagpakita og partially solid ground-glass nodule nga may sukod nga 9 mm sa wala nga ibabaw nga lobe. Hematoxylin ug eosin (H&E) staining sa gikuha nga tisyu sa baga (scale bar = 50 μm) nga nagpakita sa acinar growth pattern sa lung adenocarcinoma. Ang mga pana nagpakita sa mga nodules nga nakita sa mga CT image. Ang mga H&E image mga representante nga imahe sa daghang (>3) nga microscopic fields nga gisusi sa pathologist.
Kon tan-awon sa kinatibuk-an, ang among mga resulta nagpakita sa potensyal nga bili sa mga serum metabolite biomarker sa differential diagnosis sa mga pulmonary nodules, nga mahimong makahatag og mga hagit sa pag-evaluate sa CT screening.
Base sa usa ka validated differential metabolite panel, among gitinguha nga mailhan ang biological correlates sa mga mayor nga pagbag-o sa metabolismo. Ang KEGG pathway enrichment analysis sa MetaboAnalyst nakaila sa 6 ka komon nga significantly altered pathways tali sa duha ka gihatag nga grupo (LA vs. HC ug LA vs. BN, adjusted p ≤ 0.001, effect > 0.01). Kini nga mga pagbag-o gihulagway sa mga kagubot sa pyruvate metabolism, tryptophan metabolism, niacin ug nicotinamide metabolism, glycolysis, ang TCA cycle, ug purine metabolism (Fig. 5a). Dayon among gihimo ang targeted metabolomics aron mapamatud-an ang mga mayor nga pagbag-o gamit ang absolute quantification. Pagtino sa komon nga mga metabolite sa komon nga giusab nga mga pathway pinaagi sa triple quadrupole mass spectrometry (QQQ) gamit ang tinuod nga metabolite standards. Ang mga demograpikong kinaiya sa target sample sa pagtuon sa metabolomics gilakip sa Supplementary Table 4. Subay sa among global metabolomics results, ang quantitative analysis nagpamatuod nga ang hypoxanthine ug xanthine, pyruvate, ug lactate misaka sa LA kon itandi sa BN ug HC (Fig. 5b, c, p <0.05). Bisan pa, walay nakitang dakong kalainan niining mga metabolite tali sa BN ug HC.
Pag-analisa sa pagpayaman sa agianan sa KEGG sa managlahi nga mga metabolite sa grupo sa LA kon itandi sa mga grupo sa BN ug HC. Gigamit ang two-tailed Globaltest, ug ang mga p value gi-adjust gamit ang pamaagi sa Holm-Bonferroni (gi-adjust nga p ≤ 0.001 ug ang gidak-on sa epekto > 0.01). b–d Mga plot sa Violin nga nagpakita sa lebel sa hypoxanthine, xanthine, lactate, pyruvate, ug tryptophan sa serum HC, BN, ug LA nga gitino sa LC-MS/MS (n = 70 matag grupo). Ang puti ug itom nga tuldok-tuldok nga mga linya nagpakita sa median ug quartile, matag usa. e Ang plot sa Violin nga nagpakita sa normal nga Log2TPM (transcripts per million) mRNA expression sa SLC7A5 ug QPRT sa lung adenocarcinoma (n = 513) kon itandi sa normal nga tisyu sa baga (n = 59) sa LUAD-TCGA dataset. Ang puti nga kahon nagrepresentar sa interquartile range, ang pinahigda nga itom nga linya sa tunga nagrepresentar sa median, ug ang bertikal nga itom nga linya nga naggikan sa kahon nagrepresentar sa 95% confidence interval (CI). f Pearson correlation plot sa SLC7A5 ug GAPDH expression sa lung adenocarcinoma (n = 513) ug normal nga tisyu sa baga (n = 59) sa TCGA dataset. Ang gray area nagrepresentar sa 95% CI. r, Pearson correlation coefficient. g Normalized cellular tryptophan levels sa A549 cells nga gi-transfect gamit ang nonspecific shRNA control (NC) ug shSLC7A5 (Sh1, Sh2) nga gitino sa LC-MS/MS. Gipakita ang statistical analysis sa lima ka biologically independent samples sa matag grupo. h Cellular levels sa NADt (total NAD, lakip ang NAD+ ug NADH) sa A549 cells (NC) ug SLC7A5 knockdown A549 cells (Sh1, Sh2). Gipakita ang statistical analysis sa tulo ka biologically independent samples sa matag grupo. Ang glycolytic nga kalihokan sa mga selula sa A549 sa wala pa ug pagkahuman sa SLC7A5 knockdown gisukod pinaagi sa extracellular acidification rate (ECAR) (n = 4 ka biologically independent samples kada grupo). 2-DG,2-deoxy-D-glucose. Gigamit ang Two-tailed Student's t test sa (b–h). Sa (g–i), ang mga error bar nagrepresentar sa mean ± SD, ang matag eksperimento gihimo sa tulo ka beses nga independente ug ang mga resulta parehas. Ang source data gihatag sa porma sa source data files.
Tungod sa dakong epekto sa nausab nga metabolismo sa tryptophan sa grupo sa LA, among gisusi usab ang lebel sa serum tryptophan sa mga grupo sa HC, BN, ug LA gamit ang QQQ. Among nakita nga ang serum tryptophan mikunhod sa LA kon itandi sa HC o BN (p < 0.001, Figure 5d), nga nahiuyon sa nangaging mga nahibal-an nga ang lebel sa tryptophan sa sirkulasyon mas ubos sa mga pasyente nga adunay kanser sa baga kay sa himsog nga mga kontrol gikan sa control group33,34,35. Laing pagtuon gamit ang PET/CT tracer 11C-methyl-L-tryptophan nakakaplag nga ang oras sa pagpabilin sa signal sa tryptophan sa tisyu sa kanser sa baga miusbaw pag-ayo kon itandi sa benign lesions o normal nga tisyu36. Among gihunahuna nga ang pagkunhod sa tryptophan sa serum sa LA mahimong magpakita sa aktibo nga pag-uptake sa tryptophan sa mga selula sa kanser sa baga.
Nahibal-an usab nga ang katapusang produkto sa kynurenine pathway sa tryptophan catabolism mao ang NAD+37,38, nga usa ka importante nga substrate alang sa reaksyon sa glyceraldehyde-3-phosphate uban sa 1,3-bisphosphoglycerate sa glycolysis39. Samtang ang mga nangaging pagtuon nagpunting sa papel sa tryptophan catabolism sa immune regulation, among gitinguha nga ipatin-aw ang interaksyon tali sa tryptophan dysregulation ug glycolytic pathways nga naobserbahan sa kasamtangang pagtuon. Ang solute transporter family 7 member 5 (SLC7A5) nailhan nga usa ka tryptophan transporter43,44,45. Ang Quinolinic acid phosphoribosyltransferase (QPRT) usa ka enzyme nga nahimutang sa ubos sa kynurenine pathway nga nag-convert sa quinolinic acid ngadto sa NAMN46. Ang inspeksyon sa LUAD TCGA dataset nagpadayag nga ang SLC7A5 ug QPRT parehong miusbaw pag-ayo sa tumor tissue kon itandi sa normal nga tissue (Fig. 5e). Kini nga pagtaas naobserbahan sa mga yugto I ug II ingon man sa mga yugto III ug IV sa adenocarcinoma sa baga (Supplementary Figure 11), nga nagpakita sa sayo nga mga kagubot sa metabolismo sa tryptophan nga nalangkit sa tumorigenesis.
Dugang pa, ang LUAD-TCGA dataset nagpakita og positibo nga korelasyon tali sa SLC7A5 ug GAPDH mRNA expression sa mga sample sa pasyente sa kanser (r = 0.45, p = 1.55E-26, Figure 5f). Sa kasukwahi, walay nakitang significant correlation tali sa maong gene signatures sa normal nga tisyu sa baga (r = 0.25, p = 0.06, Figure 5f). Ang pag-knockdown sa SLC7A5 (Supplementary Figure 12) sa mga A549 cells miresulta sa pagkunhod sa cellular tryptophan ug NAD(H) levels (Figure 5g,h), nga miresulta sa pagkunhod sa glycolytic activity nga gisukod sa extracellular acidification rate (ECAR) (Figure 1). 5i). Busa, base sa metabolic changes sa serum ug in vitro detection, among gi-hypothesize nga ang tryptophan metabolism mahimong makamugna og NAD+ pinaagi sa kynurenine pathway ug adunay importanteng papel sa pagpasiugda sa glycolysis sa kanser sa baga.
Gipakita sa mga pagtuon nga ang daghang gidaghanon sa dili matino nga mga nodule sa baga nga namatikdan sa LDCT mahimong mosangpot sa panginahanglan alang sa dugang nga mga pagsulay sama sa PET-CT, biopsy sa baga, ug sobra nga pagtambal tungod sa sayop nga positibo nga diagnosis sa malignancy.31 Sama sa gipakita sa Figure 6, ang among pagtuon nakaila sa usa ka panel sa mga serum metabolite nga adunay potensyal nga diagnostic value nga mahimong makapauswag sa risk stratification ug sunod nga pagdumala sa mga nodule sa baga nga namatikdan sa CT.
Ang mga pulmonary nodule gisusi gamit ang low-dose computed tomography (LDCT) nga adunay mga imaging feature nga nagsugyot sa benign o malignant nga mga hinungdan. Ang dili sigurado nga resulta sa mga nodule mahimong mosangpot sa kanunay nga follow-up nga mga pagbisita, wala kinahanglana nga mga interbensyon, ug sobra nga pagtambal. Ang paglakip sa serum metabolic classifiers nga adunay diagnostic value mahimong makapauswag sa risk assessment ug sunod nga pagdumala sa mga pulmonary nodule. PET positron emission tomography.
Ang datos gikan sa pagtuon sa US NLST ug sa pagtuon sa European NELSON nagsugyot nga ang pag-screen sa mga grupo nga adunay taas nga risgo gamit ang low-dose computed tomography (LDCT) mahimong makapakunhod sa mortalidad sa kanser sa baga1,3. Bisan pa, ang pagtimbang-timbang sa risgo ug ang sunod nga klinikal nga pagdumala sa daghang mga incidental pulmonary nodules nga namatikdan sa LDCT nagpabilin nga labing mahagiton. Ang panguna nga katuyoan mao ang pag-optimize sa husto nga klasipikasyon sa kasamtangan nga mga protocol nga nakabase sa LDCT pinaagi sa paglakip sa kasaligan nga mga biomarker.
Ang pipila ka mga molecular biomarker, sama sa mga metabolite sa dugo, nailhan pinaagi sa pagtandi sa kanser sa baga sa himsog nga mga kontrol15,17. Sa kasamtangang pagtuon, among gipunting ang aplikasyon sa serum metabolomics analysis aron mailhan ang benign ug malignant pulmonary nodules nga aksidenteng namatikdan sa LDCT. Gitandi namo ang global serum metabolome sa himsog nga kontrol (HC), benign lung nodules (BN), ug stage I lung adenocarcinoma (LA) nga mga sample gamit ang UPLC-HRMS analysis. Nakita namo nga ang HC ug BN adunay parehas nga metabolic profiles, samtang ang LA nagpakita og mga hinungdanon nga pagbag-o kon itandi sa HC ug BN. Among nailhan ang duha ka set sa serum metabolites nga nagpalahi sa LA gikan sa HC ug BN.
Ang kasamtangang LDCT-based identification scheme para sa benign ug malignant nodules kay kasagaran gibase sa gidak-on, densidad, morphology ug growth rate sa nodules sa paglabay sa panahon30. Ang mga nangaging pagtuon nagpakita nga ang gidak-on sa nodules suod nga nalambigit sa posibilidad sa kanser sa baga. Bisan sa mga pasyente nga taas og risgo, ang risgo sa malignancy sa mga node nga <6 mm kay <1%. Ang risgo sa malignancy para sa mga node nga may sukod nga 6 ngadto sa 20 mm gikan sa 8% ngadto sa 64%30. Busa, ang Fleischner Society nagrekomendar og cutoff diameter nga 6 mm para sa routine CT follow-up.29 Apan, ang risk assessment ug management sa indeterminate pulmonary nodules (IPN) nga mas dako pa sa 6 mm wala pa hingpit nga nahimo 31. Ang kasamtangang management sa congenital heart disease kasagaran gibase sa mabinantayon nga paghulat uban ang kanunay nga CT monitoring.
Base sa gi-validate nga metabolome, among gipakita sa unang higayon ang overlap sa metabolomic signatures tali sa himsog nga mga indibidwal ug benign nodules nga <6 mm. Ang biological similarity nahiuyon sa miaging mga nahibal-an sa CT nga ang risgo sa malignancy para sa mga nodules nga <6 mm sama ka ubos sa mga subject nga walay nodes.30 Kinahanglan nga matikdan nga ang among mga resulta nagpakita usab nga ang benign nodules nga <6 mm ug ≥6 mm adunay taas nga similarity sa metabolomic profiles, nga nagsugyot nga ang functional definition sa benign etiology makanunayon bisan unsa pa ang gidak-on sa nodule. Busa, ang modernong diagnostic serum metabolite panels mahimong maghatag og usa ka assay isip rule-out test kung ang mga nodules unang nakita sa CT ug posibleng makapakunhod sa serial monitoring. Sa samang higayon, ang samang panel sa metabolic biomarkers nakaila sa malignant nodules nga ≥6 mm ang gidak-on gikan sa benign nodules ug naghatag og tukma nga mga panagna para sa mga IPN nga parehas og gidak-on ug dili klaro nga morphological features sa mga CT images. Kini nga serum metabolism classifier maayo ang performance sa pagtagna sa malignancy sa mga nodules nga ≥6 mm nga adunay AUC nga 0.927. Kon tan-awon sa kinatibuk-an, ang among mga resulta nagpakita nga ang talagsaon nga mga serum metabolomic signature mahimong espesipikong magpakita sa sayo nga mga pagbag-o sa metabolismo nga gipahinabo sa tumor ug adunay potensyal nga bili isip mga predictor sa risgo, bisan unsa pa ang gidak-on sa nodule.
Ilabi na, ang lung adenocarcinoma (LUAD) ug squamous cell carcinoma (LUSC) mao ang mga nag-unang klase sa non-small cell lung cancer (NSCLC). Tungod kay ang LUSC kusganong nalambigit sa paggamit sa tabako47 ug ang LUAD mao ang labing komon nga histology sa incidental lung nodules nga nakita sa CT screening48, ang among classifier model espesipikong gitukod alang sa stage I adenocarcinoma samples. Si Wang ug mga kauban nag-focus usab sa LUAD ug nakaila sa siyam ka lipid signatures gamit ang lipidomics aron mailhan ang early-stage lung cancer gikan sa himsog nga mga indibidwal17. Gisulayan namo ang kasamtangang classifier model sa 16 ka kaso sa stage I LUSC ug 74 ka benign nodules ug nakamatikod sa ubos nga LUSC prediction accuracy (AUC 0.776), nga nagsugyot nga ang LUAD ug LUSC mahimong adunay kaugalingon nga metabolomic signatures. Sa tinuud, ang LUAD ug LUSC gipakita nga managlahi sa etiology, biological origin ug genetic aberrations49. Busa, ang ubang mga klase sa histology kinahanglan nga ilakip sa mga training model alang sa population-based detection sa kanser sa baga sa mga screening program.
Dinhi, among giila ang unom ka labing kanunay nga giusab nga mga agianan sa adenocarcinoma sa baga kon itandi sa himsog nga mga kontrol ug benign nodules. Ang Xanthine ug hypoxanthine mga komon nga metabolite sa purine metabolic pathway. Nahiuyon sa among mga resulta, ang mga intermediate nga nalangkit sa purine metabolism miusbaw pag-ayo sa serum o mga tisyu sa mga pasyente nga adunay lung adenocarcinoma kon itandi sa himsog nga mga kontrol o mga pasyente sa preinvasive stage15,50. Ang taas nga lebel sa serum xanthine ug hypoxanthine mahimong magpakita sa anabolism nga gikinahanglan sa paspas nga pagdaghan sa mga selula sa kanser. Ang dysregulation sa glucose metabolism usa ka ilado nga timaan sa metabolismo sa kanser51. Dinhi, among naobserbahan ang usa ka hinungdanon nga pagtaas sa pyruvate ug lactate sa LA group kon itandi sa HC ug BN group, nga nahiuyon sa nangaging mga taho sa mga abnormalidad sa glycolytic pathway sa mga profile sa serum metabolome sa mga pasyente nga dili small cell lung cancer (NSCLC) ug himsog nga mga kontrol. ang mga resulta makanunayon52,53.
Importante nga among naobserbahan ang usa ka inverse correlation tali sa pyruvate ug tryptophan metabolism sa serum sa lung adenocarcinomas. Ang lebel sa serum tryptophan mikunhod sa LA group kon itandi sa HC o BN group. Makapainteres, ang usa ka miaging large-scale nga pagtuon gamit ang usa ka prospective cohort nakakaplag nga ang ubos nga lebel sa circulating tryptophan nalangkit sa dugang nga risgo sa kanser sa baga 54. Ang Tryptophan usa ka importanteng amino acid nga atong makuha gikan sa pagkaon. Among nahinapos nga ang serum tryptophan depletion sa lung adenocarcinoma mahimong magpakita sa paspas nga depletion niini nga metabolite. Nahibal-an nga ang end product sa tryptophan catabolism pinaagi sa kynurenine pathway mao ang tinubdan sa de novo NAD+ synthesis. Tungod kay ang NAD+ gihimo panguna pinaagi sa salvage pathway, ang kahinungdanon sa NAD+ sa tryptophan metabolism sa panglawas ug sakit kinahanglan pa nga mahibal-an 46. Ang among pag-analisar sa TCGA database nagpakita nga ang ekspresyon sa tryptophan transporter solute transporter 7A5 (SLC7A5) miusbaw pag-ayo sa lung adenocarcinoma kon itandi sa normal nga mga kontrol ug positibo nga nakig-uban sa ekspresyon sa glycolytic enzyme nga GAPDH. Ang mga nangaging pagtuon nag-focus sa papel sa tryptophan catabolism sa pagpugong sa antitumor immune response40,41,42. Dinhi among gipakita nga ang pagpugong sa tryptophan uptake pinaagi sa knockdown sa SLC7A5 sa mga selula sa kanser sa baga moresulta sa sunod nga pagkunhod sa lebel sa cellular NAD ug usa ka dungan nga pagkunhod sa glycolytic activity. Sa kinatibuk-an, ang among pagtuon naghatag ug biyolohikal nga basehan alang sa mga pagbag-o sa serum metabolism nga nalangkit sa malignant transformation sa lung adenocarcinoma.
Ang mga mutasyon sa EGFR mao ang labing komon nga mga mutasyon sa drayber sa mga pasyente nga adunay NSCLC. Sa among pagtuon, among nakita nga ang mga pasyente nga adunay mutasyon sa EGFR (n = 41) adunay kinatibuk-ang metabolomic profiles nga susama sa mga pasyente nga adunay wild-type EGFR (n = 31), bisan kung among nakita ang pagkunhod sa lebel sa serum sa pipila ka mga pasyente nga adunay EGFR mutant sa mga pasyente nga adunay acylcarnitine. Ang natukod nga function sa acylcarnitines mao ang pagdala sa mga acyl group gikan sa cytoplasm ngadto sa mitochondrial matrix, nga mosangpot sa oksihenasyon sa mga fatty acid aron makahimo og enerhiya 55. Nahiuyon sa among mga nahibal-an, usa ka bag-o nga pagtuon ang nakaila usab sa parehas nga mga profile sa metabolome tali sa EGFR mutant ug EGFR wild-type tumors pinaagi sa pag-analisar sa global metabolome sa 102 ka mga sample sa tisyu sa adenocarcinoma sa baga 50. Makaiikag, ang sulud sa acylcarnitine nakit-an usab sa grupo sa mutant sa EGFR. Busa, kung ang mga pagbag-o sa lebel sa acylcarnitine nagpakita sa mga pagbag-o sa metabolismo nga gipahinabo sa EGFR ug ang nagpahiping mga agianan sa molekula mahimong angayan sa dugang nga pagtuon.
Sa konklusyon, ang among pagtuon nagtukod og serum metabolic classifier para sa differential diagnosis sa pulmonary nodules ug nagsugyot og workflow nga maka-optimize sa risk assessment ug makapadali sa clinical management base sa CT scan screening.
Kini nga pagtuon giaprobahan sa Ethics Committee sa Sun Yat-sen University Cancer Hospital, ang First Affiliated Hospital sa Sun Yat-sen University, ug ang Ethics Committee sa Zhengzhou University Cancer Hospital. Sa mga grupo sa discovery ug internal validation, 174 ka sera gikan sa himsog nga mga indibidwal ug 244 ka sera gikan sa benign nodules ang nakolekta gikan sa mga indibidwal nga gipailalom sa tinuig nga medikal nga eksaminasyon sa Department of Cancer Control and Prevention, Sun Yat-sen University Cancer Center, ug 166 ka benign nodules. Ang Stage I lung adenocarcinomas nakolekta gikan sa Sun Yat-sen University Cancer Center. Sa external validation cohort, adunay 48 ka kaso sa benign nodules, 39 ka kaso sa stage I lung adenocarcinoma gikan sa First Affiliated Hospital sa Sun Yat-sen University, ug 24 ka kaso sa stage I lung adenocarcinoma gikan sa Zhengzhou Cancer Hospital. Ang Sun Yat-sen University Cancer Center nakakolekta usab og 16 ka kaso sa stage I squamous cell lung cancer aron masulayan ang diagnostic ability sa natukod nga metabolic classifier (ang mga kinaiya sa pasyente gipakita sa Supplementary Table 5). Ang mga sample gikan sa discovery cohort ug internal validation cohort gikolekta tali sa Enero 2018 ug Mayo 2020. Ang mga sample para sa external validation cohort gikolekta tali sa Agosto 2021 ug Oktubre 2022. Aron maminusan ang gender bias, halos parehas nga gidaghanon sa mga lalaki ug babaye nga kaso ang gi-assign sa matag cohort. Discovery Team ug Internal Review Team. Ang gender sa partisipante gitino base sa self-report. Nakuha ang informed consent gikan sa tanang partisipante ug walay gihatag nga kompensasyon. Ang mga subject nga adunay benign nodules mao kadtong adunay stable nga CT scan score sa 2 ngadto sa 5 ka tuig sa panahon sa pag-analisa, gawas sa 1 ka kaso gikan sa external validation sample, nga gikolekta sa wala pa ang operasyon ug nadayagnos pinaagi sa histopathology. Gawas sa chronic bronchitis. Ang mga kaso sa lung adenocarcinoma gikolekta sa wala pa ang lung resection ug gikumpirma pinaagi sa pathological diagnosis. Ang mga sample sa dugo sa wala pa ang pagpuasa gikolekta sa serum separation tubes nga walay bisan unsang anticoagulants. Ang mga sample sa dugo gi-clot sulod sa 1 ka oras sa temperatura sa kwarto ug dayon gi-centrifuge sa 2851 × g sulod sa 10 ka minuto sa 4°C aron makolekta ang serum supernatant. Ang mga serum aliquot gi-freeze sa -80°C hangtod makuha ang metabolite. Ang Department of Cancer Prevention and Medical Examination sa Sun Yat-sen University Cancer Center nakakolekta og usa ka pool sa serum gikan sa 100 ka himsog nga donor, lakip ang parehas nga gidaghanon sa mga lalaki ug babaye nga nag-edad og 40 hangtod 55 ka tuig. Parehas nga gidaghanon sa matag donor sample ang gisagol, ang resulta nga pool gi-aliquote ug gitipigan sa -80°C. Ang serum mixture gigamit isip reference material para sa quality control ug data standardization.
Ang reference serum ug test samples gitunaw ug ang mga metabolites gi-extract gamit ang combined extraction method (MTBE/methanol/tubig) 56. Sa laktod nga pagkasulti, 50 μl nga serum gisagol sa 225 μl nga ice-cold methanol ug 750 μl nga ice-cold methyl tert-butyl ether (MTBE). Sagola ang sagol ug i-incubate sa yelo sulod sa 1 ka oras. Ang mga sample gisagol dayon ug gi-vortex sagol sa 188 μl nga MS-grade nga tubig nga adunay internal standards (13C-lactate, 13C3-pyruvate, 13C-methionine, ug 13C6-isoleucine, nga gipalit gikan sa Cambridge Isotope Laboratories). Ang sagol gi-centrifuge dayon sa 15,000 × g sulod sa 10 minutos sa 4 °C, ug ang ubos nga phase gibalhin ngadto sa duha ka tubo (125 μL matag usa) para sa LC-MS analysis sa positive ug negative modes. Sa katapusan, ang sample gipauga sa usa ka high-speed vacuum concentrator hangtod nga kini moalisngaw.
Ang mga uga nga metabolite gisagol pag-usab sa 120 μl nga 80% acetonitrile, gi-vortex sulod sa 5 ka minuto, ug gi-centrifuge sa 15,000 × g sulod sa 10 ka minuto sa 4°C. Ang mga supernatant gibalhin ngadto sa mga amber glass vial nga adunay microinserts para sa metabolomics studies. Untargeted metabolomics analysis sa usa ka ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) platform. Ang mga metabolite gibulag gamit ang Dionex Ultimate 3000 UPLC system ug usa ka ACQUITY BEH Amide column (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters). Sa positive ion mode, ang mga mobile phase kay 95% (A) ug 50% acetonitrile (B), ang matag usa adunay sulod nga 10 mmol/L ammonium acetate ug 0.1% formic acid. Sa negative mode, ang mobile phases A ug B adunay 95% ug 50% acetonitrile, matag usa, ang duha ka phase adunay 10 mmol/L ammonium acetate, pH = 9. Ang gradient program mao ang mosunod: 0–0.5 min, 2% B; 0.5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16.1. min, 98 –2% B; 16.1–20 min, 2% B. Ang column gimentinar sa 40°C ug ang sample sa 10°C sa autosampler. Ang flow rate kay 0.3 ml/min, ang injection volume kay 3 μl. Usa ka Q-Exactive Orbitrap mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) nga adunay electrospray ionization (ESI) source ang gipadagan sa full scan mode ug gi-couple sa ddMS2 monitoring mode aron makakolekta og daghang volume sa data. Ang mga MS parameter gibutang sama sa mosunod: spray voltage +3.8 kV/- 3.2 kV, capillary temperature 320°C, shielding gas 40 arb, auxiliary gas 10 arb, probe heater temperature 350°C, scanning range 70–1050 m/ h, resolution. 70 000. Ang data nakuha gamit ang Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Aron masusi ang kalidad sa datos, ang mga pooled quality control (QC) sample gihimo pinaagi sa pagtangtang sa 10 μL aliquots sa supernatant gikan sa matag sample. Unom ka quality control sample injections ang gisusi sa sinugdanan sa analytical sequence aron masusi ang kalig-on sa UPLC-MS system. Ang mga quality control samples dayon ipasulod matag karon ug unya sa batch. Ang tanang 11 ka batch sa serum samples niini nga pagtuon gisusi pinaagi sa LC-MS. Ang mga aliquots sa usa ka serum pool mixture gikan sa 100 ka himsog nga donors gigamit isip reference material sa tagsa-tagsa ka batch aron mamonitor ang extraction process ug ma-adjust ang batch-to-batch effects. Ang untargeted metabolomics analysis sa discovery cohort, internal validation cohort, ug external validation cohort gihimo sa Metabolomics Center sa Sun Yat-sen University. Ang external laboratory sa Guangdong University of Technology Analysis and Testing Center nag-analisar usab sa 40 ka samples gikan sa external cohort aron masulayan ang performance sa classifier model.
Human sa pagkuha ug pag-reconstitution, ang absolute quantitation sa serum metabolites gisukod gamit ang ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (Agilent 6495 triple quadrupole) nga adunay electrospray ionization (ESI) source sa multiple reaction monitoring (MRM) mode. Usa ka ACQUITY BEH Amide column (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) ang gigamit aron ibulag ang mga metabolite. Ang mobile phase gilangkoban sa 90% (A) ug 5% acetonitrile (B) nga adunay 10 mmol/L ammonium acetate ug 0.1% ammonia solution. Ang gradient program mao ang mosunod: 0–1.5 min, 0% B; 1.5–6.5 min, 0–15% B; 6.5–8 min, 15% B; 8–8.5 min, 15%–0% B; 8.5–11.5 min, 0%B. Ang kolum gimentinar sa 40 °C ug ang sample sa 10 °C sa autosampler. Ang flow rate kay 0.3 mL/min ug ang injection volume kay 1 μL. Ang mga MS parameter gibutang sama sa mosunod: capillary voltage ±3.5 kV, nebulizer pressure 35 psi, sheath gas flow 12 L/min, sheath gas temperature 350°C, drying gas temperature 250°C, ug drying gas flow 14 l/min. Ang MRM conversions sa tryptophan, pyruvate, lactate, hypoxanthine ug xanthine kay 205.0–187.9, 87.0–43.4, 89.0–43.3, 135.0–92.3 ug 151.0–107.9 matag usa. Ang datos gikolekta gamit ang Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Para sa mga sample sa serum, ang tryptophan, pyruvate, lactate, hypoxanthine, ug xanthine gi-quantify gamit ang calibration curves sa standard mixture solutions. Para sa mga sample sa cell, ang tryptophan content gi-normalize ngadto sa internal standard ug cell protein mass.
Ang peak extraction (m/z ug retention time (RT)) gihimo gamit ang Compound Discovery 3.1 ug TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Aron mawagtang ang potensyal nga mga kalainan tali sa mga batch, ang matag kinaiya nga peak sa test sample gibahin sa kinaiya nga peak sa reference material gikan sa parehas nga batch aron makuha ang relatibong kadagaya. Ang relatibong standard deviations sa internal standards sa wala pa ug pagkahuman sa standardization gipakita sa Supplementary Table 6. Ang mga kalainan tali sa duha ka grupo gihulagway pinaagi sa false discovery rate (FDR<0.05, Wilcoxon signed rank test) ug fold change (>1.2 o <0.83). Ang hilaw nga MS data sa nakuha nga mga feature ug reference serum-corrected MS data gipakita sa Supplementary Data 1 ug Supplementary Data 2, matag usa. Ang peak annotation gihimo base sa upat ka gihubit nga lebel sa pag-ila, lakip ang giila nga mga metabolite, gituohan nga gi-annotate nga mga compound, gituohan nga gi-characterize nga mga klase sa compound, ug wala mailhi nga mga compound 22. Base sa mga pagpangita sa database sa Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), ang mga biological compound nga adunay MS/MS matching validated standards o exact match annotation sa mzCloud (score > 85) o Chemspider ang napili isip mga intermediate tali sa differential metabolome. Ang peak annotation para sa matag feature gilakip sa Supplementary Data 3. Ang MetaboAnalyst 5.0 gigamit para sa univariate analysis sa sum-normalized metabolite abundance. Ang MetaboAnalyst 5.0 nag-evaluate usab sa KEGG pathway enrichment analysis base sa significantly different metabolites. Ang Principal component analysis (PCA) ug partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) gi-analisa gamit ang ropls software package (v.1.26.4) nga adunay stack normalization ug autoscaling. Ang optimal metabolite biomarker model para sa pagtagna sa nodule malignancy gihimo gamit ang binary logistic regression nga adunay least absolute shrinkage ug selection operator (LASSO, R package v.4.1-3). Ang performance sa discriminant model sa detection ug validation sets gihulagway pinaagi sa pagbanabana sa AUC base sa ROC analysis sumala sa pROC package (v.1.18.0.). Ang optimal probability cutoff nakuha base sa maximum Youden index sa modelo (sensitivity + specificity – 1). Ang mga sample nga adunay mga kantidad nga mas ubos o mas dako kay sa threshold matagna isip benign nodules ug lung adenocarcinoma, matag usa.
Ang mga A549 nga selula (#CCL-185, American Type Culture Collection) gipatubo sa F-12K medium nga adunay 10% FBS. Ang mga short hairpin RNA (shRNA) sequences nga nagtumong sa SLC7A5 ug usa ka nontargeting control (NC) gisulod sa lentiviral vector pLKO.1-puro. Ang mga antisense sequences sa shSLC7A5 mao ang mosunod: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Ang mga antibody sa SLC7A5 (#5347) ug tubulin (#2148) gipalit gikan sa Cell Signaling Technology. Ang mga antibody sa SLC7A5 ug tubulin gigamit sa dilution nga 1:1000 para sa Western blot analysis.
Ang Seahorse XF Glycolytic Stress Test nagsukod sa lebel sa extracellular acidification (ECAR). Sa assay, ang glucose, oligomycin A, ug 2-DG gihatag nga sunod-sunod aron masulayan ang kapasidad sa cellular glycolytic nga gisukod sa ECAR.
Ang mga A549 nga selula nga gi-transfect gamit ang non-targeting control (NC) ug shSLC7A5 (Sh1, Sh2) gibutang sa tibuok gabii sa mga plato nga may diyametro nga 10 cm. Ang mga metabolite sa selula gi-extract gamit ang 1 ml nga bugnaw kaayo nga 80% nga tubigon nga methanol. Ang mga selula sa solusyon sa methanol gikiskis, gikolekta sa usa ka bag-ong tubo, ug gi-centrifuge sa 15,000 × g sulod sa 15 minutos sa 4°C. Kolektaha ang 800 µl nga supernatant ug paugha gamit ang high-speed vacuum concentrator. Ang mga pinaugang metabolite pellets gi-analisa dayon para sa lebel sa tryptophan gamit ang LC-MS/MS sama sa gihulagway sa ibabaw. Ang lebel sa cellular NAD(H) sa mga A549 nga selula (NC ug shSLC7A5) gisukod gamit ang quantitative NAD+/NADH colorimetric kit (#K337, BioVision) sumala sa mga instruksyon sa tiggama. Ang lebel sa protina gisukod para sa matag sample aron ma-normalize ang gidaghanon sa mga metabolite.
Walay gigamit nga mga pamaagi sa estadistika aron mahibal-an daan ang gidak-on sa sample. Ang mga nangaging pagtuon sa metabolomics nga nagtumong sa pagdiskobre sa biomarker15,18 giisip nga mga benchmark alang sa pagtino sa gidak-on, ug kon itandi niini nga mga report, ang among sample igo na. Walay mga sample nga wala iapil sa cohort sa pagtuon. Ang mga sample sa serum random nga gi-assign sa usa ka discovery group (306 ka mga kaso, 74.6%) ug usa ka internal validation group (104 ka mga kaso, 25.4%) alang sa wala gitarget nga mga pagtuon sa metabolomics. Random usab nga gipili namo ang 70 ka mga kaso gikan sa matag grupo gikan sa discovery set alang sa gitarget nga mga pagtuon sa metabolomics. Ang mga imbestigador wala makamatikod sa pag-assign sa grupo atol sa pagkolekta ug pag-analisa sa datos sa LC-MS. Ang mga pag-analisa sa estadistika sa datos sa metabolomics ug mga eksperimento sa selula gihulagway sa tagsa-tagsa ka mga seksyon sa Resulta, Figure Legends, ug Methods. Ang kwantipikasyon sa cellular tryptophan, NADT, ug glycolytic activity gihimo sa tulo ka beses nga independente nga adunay parehas nga mga resulta.
Alang sa dugang nga impormasyon bahin sa disenyo sa pagtuon, tan-awa ang Natural Portfolio Report Abstract nga nalangkit niini nga artikulo.
Ang hilaw nga datos sa MS sa nakuha nga mga bahin ug ang normalized nga datos sa MS sa reference serum gipakita sa Supplementary Data 1 ug Supplementary Data 2, matag usa. Ang mga peak annotation para sa differential features gipresentar sa Supplementary Data 3. Ang LUAD TCGA dataset mahimong ma-download gikan sa https://portal.gdc.cancer.gov/. Ang input data para sa pag-plot sa graph gihatag sa source data. Ang source data gihatag para niini nga artikulo.
National Lung Screening Study Group, ug uban pa. Pagpakunhod sa mortalidad tungod sa kanser sa baga gamit ang low-dose computed tomography. Northern England. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR ug Prophet, PC Screening sa kanser sa baga gamit ang low-dose helical CT: mga resulta gikan sa National Lung Screening Study (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Pagpakunhod sa mortalidad sa kanser sa baga gamit ang volumetric CT screening sa usa ka randomized trial. Northern England. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Oras sa pag-post: Sep-18-2023