Ang differential diagnosis sa pulmonary nodules nga giila sa computed tomography (CT) nagpabilin nga usa ka hagit sa clinical practice.Dinhi, gihulagway namon ang global nga metabolome sa 480 nga mga sample sa serum, lakip ang himsog nga mga kontrol, benign lung nodules, ug stage I lung adenocarcinoma.Ang mga adenocarcinomas nagpakita sa talagsaon nga mga profile sa metabolomic, samtang ang mga benign nodules ug himsog nga mga indibidwal adunay taas nga pagkaparehas sa mga profile sa metabolismo.Sa grupo nga nadiskobrehan (n = 306), usa ka set sa 27 ka metabolites ang giila nga makalahi tali sa benign ug malignant nodules.Ang AUC sa discriminant model sa internal validation (n = 104) ug external validation (n = 111) nga mga grupo mao ang 0.915 ug 0.945, matag usa.Ang pag-analisar sa agianan nagpadayag sa dugang nga glycolytic metabolites nga may kalabutan sa pagkunhod sa tryptophan sa baga nga adenocarcinoma serum kumpara sa mga benign nodules ug himsog nga mga kontrol, ug nagsugyot nga ang tryptophan uptake nagpasiugda sa glycolysis sa mga selula sa kanser sa baga.Ang among pagtuon nagpasiugda sa bili sa serum metabolite biomarkers sa pag-assess sa risgo sa pulmonary nodules nga nakita sa CT.
Ang sayo nga pagdayagnos hinungdanon aron mapauswag ang rate sa pagkaluwas sa mga pasyente sa kanser.Ang mga resulta gikan sa US National Lung Cancer Screening Trial (NLST) ug sa European NELSON Study nagpakita nga ang screening nga adunay ubos nga dosis nga computed tomography (LDCT) makapakunhod pag-ayo sa lung cancer mortality sa high-risk groups1,2,3.Sukad sa kaylap nga paggamit sa LDCT alang sa screening sa kanser sa baga, ang insidente sa incidental radiographic findings sa asymptomatic pulmonary nodules nagpadayon sa pagdugang 4.Ang mga pulmonary nodules gihubit nga mga focal opacities hangtod sa 3 cm ang diyametro 5 .Nag-atubang kami og mga kalisud sa pagtimbang-timbang sa posibilidad sa malignancy ug pag-atubang sa daghang gidaghanon sa mga pulmonary nodules nga nakit-an nga sulagma sa LDCT.Ang mga limitasyon sa CT mahimong mosangpot sa kanunay nga follow-up nga mga eksaminasyon ug sayop nga positibo nga mga resulta, nga mosangpot sa wala kinahanglana nga interbensyon ug sobra nga pagtambal6.Busa, adunay panginahanglan sa pagpalambo sa kasaligan ug mapuslanon nga mga biomarker aron sa hustong pag-ila sa kanser sa baga sa unang mga hugna ug paglainlain sa kadaghanang benign nodules sa inisyal nga pagkakita 7.
Ang komprehensibo nga pag-analisa sa molekula sa dugo (serum, plasma, peripheral blood mononuclear cells), lakip ang genomics, proteomics o DNA methylation8,9,10, misangpot sa nagkadako nga interes sa pagkadiskobre sa diagnostic biomarkers alang sa kanser sa baga.Samtang, ang mga pamaagi sa metabolismo nagsukod sa mga produkto sa katapusan sa cellular nga naimpluwensyahan sa endogenous ug exogenous nga mga aksyon ug busa gigamit aron matagna ang pagsugod ug sangputanan sa sakit.Ang liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS) kay kaylap nga gigamit nga pamaagi para sa metabolomics studies tungod sa taas nga sensitivity ug dako nga dynamic range, nga makatabon sa metabolites nga adunay lain-laing physicochemical properties11,12,13.Bisan tuod ang global metabolomic analysis sa plasma/serum gigamit sa pag-ila sa mga biomarker nga nalangkit sa lung cancer diagnosis14,15,16,17 ug treatment efficacy, 18 serum metabolite classifiers sa pag-ila tali sa benign ug malignant lung nodules nagpabilin nga daghan nga gitun-an.- kaylap nga panukiduki.
Ang Adenocarcinoma ug squamous cell carcinoma mao ang duha ka nag-unang subtype sa non-small cell lung cancer (NSCLC).Ang lain-laing mga pagsulay sa CT screening nagpakita nga ang adenocarcinoma mao ang labing komon nga histological nga matang sa kanser sa baga1,19,20,21.Niini nga pagtuon, gigamit namo ang ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) aron sa paghimo sa metabolomics analysis sa total nga 695 serum samples, lakip ang himsog nga mga kontrol, benign pulmonary nodules, ug CT-detected ≤3 cm.Pagsusi alang sa Stage I nga adenocarcinoma sa baga.Gipaila namo ang usa ka panel sa serum metabolites nga nagpalahi sa lung adenocarcinoma gikan sa benign nodules ug healthy controls.Pathway enrichment analysis nagpadayag nga ang abnormal nga tryptophan ug glucose metabolismo kasagarang mga kausaban sa lung adenocarcinoma kumpara sa benign nodules ug healthy controls.Sa katapusan, among gitukod ug gi-validate ang usa ka serum metabolic classifier nga adunay taas nga espesipiko ug pagkasensitibo sa pag-ila tali sa malignant ug benign pulmonary nodules nga nakit-an sa LDCT, nga mahimong makatabang sa sayo nga differential diagnosis ug risk assessment.
Sa kasamtangan nga pagtuon, ang sekso ug edad-matched serum samples retrospectively nakolekta gikan sa 174 himsog nga kontrol, 292 mga pasyente uban sa benign pulmonary nodules, ug 229 mga pasyente uban sa stage I baga adenocarcinoma.Ang mga kinaiya sa demograpiko sa 695 nga mga hilisgutan gipakita sa Supplementary Table 1.
Ingon sa gipakita sa Figure 1a, usa ka kinatibuk-an nga 480 nga mga sample sa serum, lakip ang 174 nga himsog nga kontrol (HC), 170 nga benign nodules (BN), ug 136 nga yugto sa lung adenocarcinoma (LA) nga mga sample, nakolekta sa Sun Yat-sen University Cancer Center.Discovery cohort para sa untargeted metabolomic profiling gamit ang ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS).Sama sa gipakita sa Supplementary Figure 1, ang mga differential metabolites tali sa LA ug HC, LA ug BN giila aron magtukod og usa ka modelo sa klasipikasyon ug dugang nga pagsusi sa differential pathway analysis.104 ka mga sample nga nakolekta sa Sun Yat-sen University Cancer Center ug 111 ka mga sample nga nakolekta sa laing duha ka ospital ang gipailalom sa internal ug external validation, matag usa.
usa ka populasyon sa Pagtuon sa cohort sa pagkadiskobre nga miagi sa global serum metabolomics analysis gamit ang ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS).b Partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) sa kinatibuk-ang metabolome sa 480 serum samples gikan sa study cohort, lakip ang healthy controls (HC, n = 174), benign nodules (BN, n = 170), ug stage I lung adenocarcinoma (Los Angeles, n = 136).+ ESI, positibo nga electrospray ionization mode, -ESI, negatibo nga electrospray ionization mode.c-e Metabolites uban sa mahinungdanon nga lain-laing mga kadagaya sa duha ka gihatag nga mga grupo (two-tailed Wilcoxon gipirmahan ranggo test, sayop nga pagkadiskobre rate adjust p value, FDR <0.05) gipakita sa pula (pilo kausaban > 1.2) ug asul (pilo kausaban <0.83) .) gipakita sa graphic sa bulkan.f Hierarchical clustering heat map nga nagpakita sa mahinungdanong kalainan sa gidaghanon sa annotated metabolites tali sa LA ug BN.Ang gigikanan nga datos gihatag sa porma sa mga file sa gigikanan nga datos.
Ang kinatibuk-ang serum metabolome sa 174 HC, 170 BN ug 136 LA sa nadiskobrehan nga grupo gisusi gamit ang UPLC-HRMS analysis.Una namong gipakita nga ang quality control (QC) samples cluster hugot sa sentro sa unsupervised principal component analysis (PCA) nga modelo, nga nagpamatuod sa kalig-on sa performance sa kasamtangan nga pagtuon (Supplementary Figure 2).
Sama sa gipakita sa partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) sa Figure 1 b, among nakita nga adunay klaro nga kalainan tali sa LA ug BN, LA ug HC sa positibo (+ ESI) ug negatibo (-ESI) electrospray ionization modes .nahimulag.Bisan pa, wala’y nakit-an nga hinungdanon nga mga kalainan tali sa BN ug HC sa + ESI ug -ESI nga mga kondisyon.
Nakit-an namo ang 382 differential features tali sa LA ug HC, 231 differential features tali sa LA ug BN, ug 95 differential features tali sa BN ug HC (Wilcoxon signed rank test, FDR <0.05 ug multiple change>1.2 or <0.83) (Figure .1c-e )..Ang mga taluktok dugang nga gi-annotate (Supplementary Data 3) batok sa usa ka database (mzCloud/HMDB/Chemspider library) pinaagi sa m/z value, retention time ug fragmentation mass spectrum search (mga detalye nga gihulagway sa Methods section) 22.Sa katapusan, ang 33 ug 38 annotated metabolites nga adunay mahinungdanong kalainan sa kadagaya giila alang sa LA versus BN (Figure 1f ug Supplementary Table 2) ug LA versus HC (Supplementary Figure 3 ug Supplementary Table 2), matag usa.Sa kasukwahi, 3 lamang ka metabolites nga adunay mahinungdanong kalainan sa kadagaya ang giila sa BN ug HC (Supplementary Table 2), nga nahiuyon sa overlap tali sa BN ug HC sa PLS-DA.Kini nga mga differential metabolites naglangkob sa usa ka halapad nga mga biochemicals (Supplementary Figure 4).Sa tingub, kini nga mga resulta nagpakita sa mahinungdanon nga mga pagbag-o sa serum metabolome nga nagpakita sa malignant nga pagbag-o sa sayo nga yugto sa kanser sa baga kon itandi sa mga benign lung nodules o himsog nga mga subject.Samtang, ang pagkaparehas sa serum metabolome sa BN ug HC nagsugyot nga ang mga benign pulmonary nodules mahimong magpaambit sa daghang biological nga mga kinaiya sa himsog nga mga indibidwal.Gihatag nga ang epidermal growth factor receptor (EGFR) nga mutation sa gene kasagaran sa baga nga adenocarcinoma subtype 23, among gitinguha nga mahibal-an ang epekto sa mutation sa drayber sa serum metabolome.Gisusi dayon namo ang kinatibuk-ang profile sa metabolomic sa 72 nga mga kaso nga adunay status sa EGFR sa grupo sa adenocarcinoma sa baga.Makapainteres, nakit-an namon ang managsama nga mga profile tali sa mga pasyente nga mutant sa EGFR (n = 41) ug mga pasyente nga wild-type nga EGFR (n = 31) sa pag-analisar sa PCA (Supplementary Figure 5a).Bisan pa, nahibal-an namon ang 7 nga mga metabolite kansang kadaghan nausab sa mga pasyente nga adunay mutation sa EGFR kumpara sa mga pasyente nga adunay wild-type nga EGFR (t test, p <0.05 ug pagbag-o sa pilo> 1.2 o <0.83) (Supplementary Figure 5b).Ang kadaghanan sa kini nga mga metabolite (5 sa 7) mga acylcarnitines, nga adunay hinungdanon nga papel sa mga agianan sa oksihenasyon sa fatty acid.
Ingon sa gihulagway sa workflow nga gipakita sa Figure 2 a, ang mga biomarker alang sa klasipikasyon sa nodule nakuha gamit ang pinakagamay nga absolute shrinkage operators ug pagpili base sa 33 differential metabolites nga giila sa LA (n = 136) ug BN (n = 170).Labing maayo nga kombinasyon sa mga variable (LASSO) - binary logistic regression model.Napulo ka pilo nga cross-validation ang gigamit sa pagsulay sa pagkakasaligan sa modelo.Ang variable nga pagpili ug pag-regularize sa parameter gi-adjust pinaagi sa posibilidad nga maximization nga silot nga adunay parameter λ24.Ang global metabolomics analysis dugang nga gihimo nga independente sa internal validation (n = 104) ug external validation (n = 111) nga mga grupo aron sulayan ang klasipikasyon nga performance sa discriminant model.Ingon nga resulta, ang 27 metabolites sa discovery set giila nga labing maayo nga discriminant nga modelo nga adunay pinakadako nga mean AUC value (Fig. 2b), diin ang 9 adunay dugang nga kalihokan ug ang 18 mikunhod nga kalihokan sa LA kumpara sa BN (Fig. 2c).
Workflow alang sa pagtukod sa usa ka pulmonary nodule classifier, lakip na ang pagpili sa pinakamaayong panel sa serum metabolites sa discovery set gamit ang binary logistic regression model pinaagi sa napulo ka pilo nga cross-validation ug pag-evaluate sa predictive performance sa internal ug external validation sets.b Cross-validation statistics sa LASSO regression model alang sa metabolic biomarker selection.Ang mga numero nga gihatag sa ibabaw nagrepresentar sa kasagaran nga gidaghanon sa mga biomarker nga gipili sa usa ka gihatag nga λ.Ang pula nga tuldok nga linya nagrepresentar sa kasagaran nga kantidad sa AUC sa katugbang nga lambda.Ang mga gray nga error bar nagrepresentar sa minimum ug maximum nga mga kantidad sa AUC.Ang tuldok nga linya nagpaila sa pinakamaayong modelo nga adunay 27 ka piniling biomarker.AUC, lugar ubos sa kurba sa receiver operating characteristic (ROC).c Pil-a ang mga pagbag-o sa 27 ka pinili nga metabolites sa LA group kumpara sa BN group sa discovery nga grupo.Pula nga kolum - pagpaaktibo.Ang asul nga kolum usa ka pagkunhod.d–f Receiver operating characteristic (ROC) curves nga nagpakita sa gahom sa discriminant model base sa 27 metabolite combinations sa discovery, internal, ug external validation sets.Ang gigikanan nga datos gihatag sa porma sa mga file sa gigikanan nga datos.
Ang usa ka modelo sa panagna gihimo base sa gibug-aton nga mga coefficient sa regression niining 27 metabolites (Supplementary Table 3).Ang pag-analisa sa ROC nga gibase sa kini nga 27 nga mga metabolite naghatag usa ka lugar sa ilawom sa kurba (AUC) nga kantidad nga 0.933, ang pagkasensitibo sa grupo sa pagkadiskobre mao ang 0.868, ug ang espesipiko mao ang 0.859 (Fig. 2d).Samtang, taliwala sa 38 annotated differential metabolites tali sa LA ug HC, usa ka set sa 16 metabolites nakab-ot ang AUC sa 0.902 nga adunay sensitivity sa 0.801 ug specificity sa 0.856 sa discriminating LA gikan sa HC (Supplementary Figure 6a-c).Gikumpara usab ang mga kantidad sa AUC nga gibase sa lainlaing mga threshold sa pagbag-o sa fold alang sa mga differential metabolites.Nakita namon nga ang modelo sa klasipikasyon labing maayo sa pagpihig tali sa LA ug BN (HC) kung ang lebel sa pagbag-o sa fold gitakda sa 1.2 kumpara sa 1.5 o 2.0 (Supplementary Figure 7a, b).Ang modelo sa klasipikasyon, base sa 27 ka metabolite nga mga grupo, dugang nga gi-validate sa internal ug external nga mga cohorts.Ang AUC mao ang 0.915 (sensitivity 0.867, specificity 0.811) alang sa internal validation ug 0.945 (sensitivity 0.810, specificity 0.979) alang sa external validation (Fig. 2e, f).Aron masusi ang interlaboratory efficiency, ang 40 nga mga sample gikan sa external cohort gisusi sa usa ka eksternal nga laboratoryo nga gihulagway sa seksyon sa Mga Pamaagi.Ang katukma sa klasipikasyon nakab-ot ang usa ka AUC nga 0.925 (Supplementary Figure 8).Tungod kay ang lung squamous cell carcinoma (LUSC) mao ang ikaduha nga kasagarang subtype sa non-small cell lung cancer (NSCLC) human sa lung adenocarcinoma (LUAD), gisulayan usab namo ang validated potential utility sa metabolic profiles.BN ug 16 ka kaso sa LUSC.Ang AUC sa diskriminasyon tali sa LUSC ug BN kay 0.776 (Supplementary Figure 9), nga nagpakita sa mas kabus nga abilidad kumpara sa diskriminasyon tali sa LUAD ug BN.
Gipakita sa mga pagtuon nga ang gidak-on sa mga nodule sa CT nga mga hulagway positibo nga may kalabutan sa kalagmitan sa malignancy ug nagpabilin nga usa ka mayor nga determinant sa pagtambal sa nodule25,26,27.Ang pag-analisa sa datos gikan sa dako nga grupo sa NELSON screening nga pagtuon nagpakita nga ang risgo sa malignancy sa mga subject nga adunay mga node <5 mm parehas sa mga subject nga walay nodes 28.Busa, ang minimum nga gidak-on nga nagkinahanglan sa regular nga CT monitoring mao ang 5 mm, ingon sa girekomenda sa British Thoracic Society (BTS), ug 6 mm, ingon sa girekomendar sa Fleischner Society 29.Bisan pa, ang mga nodul nga mas dako sa 6 mm ug walay klaro nga benign features, nga gitawag ug indeterminate pulmonary nodules (IPN), nagpabilin nga usa ka dakong hagit sa pagtimbang-timbang ug pagdumala sa clinical practice30,31.Sunod namong gisusi kung ang gidak-on sa nodule nakaimpluwensya sa mga pirma sa metabolismo gamit ang mga pooled sample gikan sa nadiskobrehan ug internal nga validation cohorts.Pag-focus sa 27 validated biomarkers, una namong gitandi ang mga profile sa PCA sa HC ug BN sub-6 mm metabolomes.Among nakit-an nga kadaghanan sa mga punto sa datos alang sa HC ug BN nagsapaw, nga nagpakita nga ang lebel sa serum metabolite parehas sa duha ka grupo (Fig. 3a).Ang feature nga mga mapa sa nagkalainlaing gidak-on sa gidak-on nagpabilin nga gikonserba sa BN ug LA (Fig. 3b, c), samtang ang usa ka panagbulag naobserbahan tali sa malignant ug benign nodules sa 6-20 mm range (Fig. 3d).Kini nga grupo adunay AUC nga 0.927, espesipiko sa 0.868, ug sensitivity sa 0.820 alang sa pagtagna sa malignancy sa nodules nga nagsukod sa 6 ngadto sa 20 mm (Fig. 3e, f).Gipakita sa among mga resulta nga mahimo’g makuha sa classifier ang mga pagbag-o sa metaboliko nga gipahinabo sa sayo nga malignant nga pagbag-o, bisan unsa pa ang gidak-on sa nodule.
ad Pagtandi sa mga profile sa PCA tali sa piho nga mga grupo base sa usa ka metabolic classifier sa 27 metabolites.CC ug BN <6 mm.b BN < 6 mm batok sa BN 6–20 mm.sa LA 6–20 mm kumpara sa LA 20–30 mm.g BN 6–20 mm ug LA 6–20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20-30 mm, n = 77. e Receiver operating characteristic (ROC) curve nga nagpakita sa discriminant model performance alang sa nodules 6-20 mm.f Ang mga kantidad sa kalagmitan gikalkulo base sa modelo sa logistic regression alang sa mga nodul nga may sukod nga 6-20 mm.Ang gray nga tuldok nga linya nagrepresentar sa labing maayo nga kantidad sa cutoff (0.455).Ang mga numero sa ibabaw nagrepresentar sa porsyento sa mga kaso nga giplano alang sa Los Angeles.Gamit ug two-tailed Student's t test.PCA, panguna nga pagtuki sa sangkap.AUC nga lugar sa ilawom sa kurba.Ang gigikanan nga datos gihatag sa porma sa mga file sa gigikanan nga datos.
Upat ka mga sample (nag-edad 44-61 ka tuig) nga adunay parehas nga gidak-on sa pulmonary nodule (7-9 mm) ang dugang nga gipili aron ihulagway ang paghimo sa gisugyot nga modelo sa prediksiyon sa malignancy (Fig. 4a, b).Sa inisyal nga screening, ang Case 1 gipresentar isip usa ka solid nodule nga adunay calcification, usa ka feature nga may kalabutan sa benignity, samtang ang Case 2 gipresentar isip usa ka indeterminate partially solid nodule nga walay klaro nga benign features.Tulo ka hugna sa follow-up nga CT scan nagpakita nga kini nga mga kaso nagpabilin nga lig-on sulod sa 4 ka tuig nga yugto ug busa giisip nga benign nodules (Fig. 4a).Kon itandi sa clinical evaluation sa serial CT scans, single-shot serum metabolite analysis uban sa kasamtangan nga classifier model dali ug husto nga giila kini nga mga benign nodules base sa probabilistic constraints (Table 1).Ang Figure 4b sa kaso nga 3 nagpakita sa usa ka nodule nga adunay mga timailhan sa pleural retraction, nga kasagaran nalangkit sa malignancy32.Ang kaso 4 gipresentar isip usa ka dili matino nga partially solid nodule nga walay ebidensya sa usa ka dili maayo nga hinungdan.Ang tanan niini nga mga kaso gitagna nga malignant sumala sa modelo sa classifier (Table 1).Ang assessment sa lung adenocarcinoma gipakita pinaagi sa histopathological examination human sa lung resection surgery (Fig. 4b).Alang sa eksternal nga validation set, ang metabolic classifier tukma nga nagtagna sa duha ka mga kaso sa dili matino nga mga nodules sa baga nga mas dako pa sa 6 mm (Supplementary Figure 10).
Mga hulagway sa CT sa axial window sa baga sa duha ka kaso sa benign nodules.Sa kaso 1, ang CT scan human sa 4 ka tuig nagpakita sa usa ka lig-on nga solid nodule nga may sukod nga 7 mm nga adunay calcification sa tuo nga ubos nga lobe.Sa kaso 2, ang CT scan human sa 5 ka tuig nagpakita sa usa ka lig-on, partially solid nodule nga adunay diametro nga 7 mm sa tuo nga ibabaw nga lobe.b Axial window CT nga mga hulagway sa mga baga ug katugbang nga pathological nga mga pagtuon sa duha ka mga kaso sa stage I adenocarcinoma sa wala pa ang resection sa baga.Ang kaso 3 nagpadayag sa usa ka nodule nga adunay diyametro nga 8 mm sa tuo nga taas nga lobe nga adunay pleural retraction.Ang kaso 4 nagpadayag sa usa ka partially solid ground-glass nodule nga may sukod nga 9 mm sa wala nga taas nga lobe.Hematoxylin ug eosin (H&E) pagmantsa sa giputol nga tisyu sa baga (scale bar = 50 μm) nga nagpakita sa acinar growth pattern sa lung adenocarcinoma.Ang mga pana nagpaila sa mga bukol nga nakit-an sa mga imahe sa CT.Ang mga hulagway sa H&E kay representatibo nga mga hulagway sa daghang (>3) nga mikroskopikong mga natad nga gisusi sa pathologist.
Gikuha sa tingub, ang among mga resulta nagpakita sa potensyal nga bili sa serum metabolite biomarkers sa differential diagnosis sa pulmonary nodules, nga mahimong maghatag og mga hagit sa pag-evaluate sa CT screening.
Pinasukad sa usa ka balido nga differential metabolite panel, among gitinguha nga mailhan ang mga biolohikal nga correlates sa mga dagkong pagbag-o sa metaboliko.Ang KEGG pathway enrichment analysis pinaagi sa MetaboAnalyst nagpaila sa 6 nga komon nga mahinungdanon nga giusab nga mga agianan tali sa duha ka gihatag nga mga grupo (LA vs. HC ug LA vs. BN, adjust p ≤ 0.001, epekto> 0.01).Kini nga mga kausaban gihulagway pinaagi sa mga kasamok sa pyruvate metabolismo, tryptophan metabolismo, niacin ug nicotinamide metabolismo, glycolysis, ang TCA cycle, ug purine metabolismo (Fig. 5a).Gipadayon namon ang gipunting nga metabolomics aron mapamatud-an ang mga dagkong pagbag-o gamit ang hingpit nga pag-ihap.Pagdeterminar sa mga komon nga metabolite sa kasagarang giusab nga mga agianan pinaagi sa triple quadrupole mass spectrometry (QQQ) gamit ang tinuod nga metabolite nga mga sumbanan.Ang demographic nga mga kinaiya sa metabolomics study target sample gilakip sa Supplementary Table 4. Nahiuyon sa atong global nga metabolomics nga mga resulta, ang quantitative analysis nagpamatuod nga ang hypoxanthine ug xanthine, pyruvate, ug lactate nadugangan sa LA kumpara sa BN ug HC (Fig. 5b, c, p <0.05).Bisan pa, wala’y hinungdan nga mga kalainan sa kini nga mga metabolite nga nakit-an tali sa BN ug HC.
KEGG pathway enrichment analysis sa mahinungdanong lain-laing metabolites sa LA group kumpara sa BN ug HC groups.Gigamit ang duha ka ikog nga Globaltest, ug ang mga p value gi-adjust gamit ang pamaagi sa Holm-Bonferroni (gipasibo p ≤ 0.001 ug gidak-on sa epekto > 0.01).b–d Violin plots nga nagpakita sa hypoxanthine, xanthine, lactate, pyruvate, ug tryptophan nga lebel sa serum HC, BN, ug LA nga gitino sa LC-MS/MS (n = 70 kada grupo).Ang puti ug itom nga tuldok nga mga linya nagpakita sa median ug quartile, matag usa.e Violin plot nga nagpakita sa normal nga Log2TPM (transcripts kada milyon) mRNA nga ekspresyon sa SLC7A5 ug QPRT sa lung adenocarcinoma (n = 513) kumpara sa normal nga tissue sa baga (n = 59) sa LUAD-TCGA dataset.Ang puti nga kahon nagrepresentar sa interquartile range, ang pinahigda nga itom nga linya sa sentro nagrepresentar sa median, ug ang bertikal nga itom nga linya nga naglugway gikan sa kahon nagrepresentar sa 95% confidence interval (CI).f Pearson correlation plot sa SLC7A5 ug GAPDH nga ekspresyon sa lung adenocarcinoma (n = 513) ug normal nga tissue sa baga (n = 59) sa TCGA dataset.Ang gray nga lugar nagrepresentar sa 95% CI.r, Pearson correlation coefficient.g Na-normalize ang lebel sa cellular tryptophan sa A549 nga mga selyula nga gibalhin uban ang nonspecific shRNA control (NC) ug shSLC7A5 (Sh1, Sh2) nga gitino sa LC-MS/MS.Gipresentar ang estadistika nga pagtuki sa lima ka biologically independent sample sa matag grupo.h Cellular nga lebel sa NADt (total NAD, lakip ang NAD + ug NADH) sa A549 cells (NC) ug SLC7A5 knockdown A549 cells (Sh1, Sh2).Gipresentar ang estadistika nga pagtuki sa tulo ka biologically independent sample sa matag grupo.i Glycolytic nga kalihokan sa A549 mga selula sa wala pa ug human sa SLC7A5 knockdown gisukod pinaagi sa extracellular acidification rate (ECAR) (n = 4 biologically independente samples matag grupo).2-DG,2-deoxy-D-glucose.Ang two-tailed Student's t test gigamit sa (b–h).Sa (g-i), ang mga error bar nagrepresentar sa mean ± SD, ang matag eksperimento gihimo tulo ka beses nga independente ug ang mga resulta parehas.Ang gigikanan nga datos gihatag sa porma sa mga file sa gigikanan nga datos.
Gikonsiderar ang hinungdanon nga epekto sa giusab nga metabolismo sa tryptophan sa grupo sa LA, gisusi usab namon ang lebel sa serum tryptophan sa mga grupo sa HC, BN, ug LA gamit ang QQQ.Nakita namon nga ang serum tryptophan mikunhod sa LA kumpara sa HC o BN (p <0.001, Figure 5d), nga nahiuyon sa nangaging mga nahibal-an nga ang naglibot nga lebel sa tryptophan mas ubos sa mga pasyente nga adunay kanser sa baga kaysa sa himsog nga kontrol gikan sa control group33,34 ,35.Ang laing pagtuon gamit ang PET/CT tracer 11C-methyl-L-tryptophan nakit-an nga ang tryptophan signal retention time sa tissue sa kanser sa baga dako kaayog nadugang kumpara sa benign lesions o normal nga tissue36.Gipanghimatuud namon nga ang pagkunhod sa tryptophan sa LA serum mahimo’g magpakita sa aktibo nga pagsuyup sa tryptophan sa mga selula sa kanser sa baga.
Nahibal-an usab nga ang katapusan nga produkto sa kynurenine nga agianan sa tryptophan catabolism mao ang NAD + 37,38, nga usa ka hinungdanon nga substrate alang sa reaksyon sa glyceraldehyde-3-phosphate nga adunay 1,3-bisphosphoglycerate sa glycolysis39.Samtang ang mga nangaging mga pagtuon naka-focus sa papel sa tryptophan catabolism sa immune regulation, gitinguha namon nga ipatin-aw ang interplay tali sa tryptophan dysregulation ug glycolytic nga mga agianan nga naobserbahan sa karon nga pagtuon.Ang solute transporter family 7 member 5 (SLC7A5) nailhan nga tryptophan transporter43,44,45.Ang Quinolinic acid phosphoribosyltransferase (QPRT) usa ka enzyme nga nahimutang sa ubos sa agianan sa kynurenine nga nag-convert sa quinolinic acid ngadto sa NAMN46.Ang pag-inspeksyon sa dataset sa LUAD TCGA nagpadayag nga ang SLC7A5 ug QPRT dako kaayog na-upregulated sa tumor tissue kumpara sa normal nga tissue (Fig. 5e).Kini nga pagtaas naobserbahan sa mga yugto sa I ug II ingon man sa mga yugto sa III ug IV sa adenocarcinoma sa baga (Supplementary Figure 11), nga nagpakita sa sayo nga mga kasamok sa metabolismo sa tryptophan nga may kalabutan sa tumorigenesis.
Dugang pa, ang LUAD-TCGA nga dataset nagpakita sa usa ka positibo nga correlation tali sa SLC7A5 ug GAPDH mRNA nga ekspresyon sa mga sample sa pasyente sa kanser (r = 0.45, p = 1.55E-26, Figure 5f).Sa kasukwahi, walay mahinungdanon nga correlation ang nakit-an tali sa maong mga pirma sa gene sa normal nga tissue sa baga (r = 0.25, p = 0.06, Figure 5f).Ang pag-knockdown sa SLC7A5 (Supplementary Figure 12) sa A549 nga mga selula mahinungdanon nga nakunhuran ang cellular tryptophan ug NAD (H) nga lebel (Figure 5g, h), nga miresulta sa attenuated glycolytic activity nga gisukod sa extracellular acidification rate (ECAR) (Figure 1).5i).Sa ingon, base sa mga pagbag-o sa metaboliko sa serum ug in vitro detection, among gi-hypothesize nga ang metabolismo sa tryptophan mahimo’g maghimo NAD + pinaagi sa agianan sa kynurenine ug adunay hinungdanon nga papel sa pagpauswag sa glycolysis sa kanser sa baga.
Gipakita sa mga pagtuon nga ang daghang gidaghanon sa dili matino nga pulmonary nodules nga nakit-an sa LDCT mahimong mosangput sa panginahanglan alang sa dugang nga pagsulay sama sa PET-CT, biopsy sa baga, ug sobra nga pagtambal tungod sa usa ka sayup nga positibo nga diagnosis sa malignancy.31 Sama sa gipakita sa Figure 6, Ang among pagtuon nag-ila sa usa ka panel sa serum metabolites nga adunay potensyal nga diagnostic value nga mahimong makapauswag sa risk stratification ug sunod-sunod nga pagdumala sa pulmonary nodules nga nakita sa CT.
Ang mga pulmonary nodules gi-evaluate gamit ang low-dose computed tomography (LDCT) nga adunay imaging features nga nagsugyot sa benign o malignant nga mga hinungdan.Ang dili sigurado nga sangputanan sa mga bukol mahimong mosangpot sa kanunay nga pag-follow-up nga mga pagbisita, wala kinahanglana nga mga interbensyon, ug sobra nga pagtambal.Ang paglakip sa serum metabolic classifiers nga adunay diagnostic value mahimong makapauswag sa risk assessment ug sa sunod nga pagdumala sa pulmonary nodules.PET positron emission tomography.
Ang datos gikan sa pagtuon sa US NLST ug sa European NELSON nga pagtuon nagsugyot nga ang pag-screen sa high-risk nga mga grupo nga adunay low-dose computed tomography (LDCT) mahimong makapakunhod sa pagkamatay sa kanser sa baga1,3.Bisan pa, ang pagtimbang-timbang sa peligro ug ang sunod nga pagdumala sa klinika sa daghang gidaghanon sa mga insidente nga pulmonary nodules nga nakit-an sa LDCT nagpabilin nga labing mahagiton.Ang nag-unang tumong mao ang pag-optimize sa husto nga klasipikasyon sa kasamtangan nga LDCT-based nga mga protocol pinaagi sa paglakip sa kasaligang biomarker.
Ang pila ka molekula nga biomarker, sama sa mga metabolite sa dugo, nahibal-an pinaagi sa pagtandi sa kanser sa baga nga adunay himsog nga mga kontrol15,17.Sa kasamtangan nga pagtuon, kami naka-focus sa paggamit sa serum metabolomics analysis sa pag-ila tali sa benign ug malignant pulmonary nodules incidentally detected sa LDCT.Gikumpara namo ang global serum metabolome sa healthy control (HC), benign lung nodules (BN), ug stage I lung adenocarcinoma (LA) samples gamit ang UPLC-HRMS analysis.Nakita namon nga ang HC ug BN adunay parehas nga mga profile sa metaboliko, samtang ang LA nagpakita mga hinungdanon nga pagbag-o kumpara sa HC ug BN.Gipaila namo ang duha ka set sa serum metabolites nga nagpalahi sa LA gikan sa HC ug BN.
Ang kasamtangang LDCT-based identification scheme para sa benign ug malignant nga mga nodule kay nag-una base sa gidak-on, densidad, morphology ug growth rate sa nodules sa paglabay sa panahon30.Gipakita sa nangaging mga pagtuon nga ang gidak-on sa mga nodules suod nga nalangkit sa posibilidad sa kanser sa baga.Bisan sa high-risk nga mga pasyente, ang risgo sa malignancy sa mga node <6 mm kay <1%.Ang risgo sa malignancy alang sa mga nodules nga may sukod nga 6 ngadto sa 20 mm gikan sa 8% ngadto sa 64%30.Busa, girekomenda sa Fleischner Society ang cutoff diameter nga 6 mm alang sa naandan nga pag-follow-up sa CT.29 Apan, ang risk assessment ug pagdumala sa indeterminate pulmonary nodules (IPN) nga mas dako pa sa 6 mm wala pa igo nga nahimo 31 .Ang kasamtangan nga pagdumala sa congenital heart disease kasagaran gibase sa mabinantayon nga paghulat uban sa kanunay nga pag-monitor sa CT.
Base sa validated nga metabolome, among gipakita sa unang higayon ang overlap sa metabolomic signatures tali sa himsog nga mga indibidwal ug benign nodules <6 mm.Ang biolohikal nga pagkaparehas nahiuyon sa nangaging mga nahibal-an sa CT nga ang risgo sa malignancy alang sa mga nodules <6 mm mao ang ubos sa mga subject nga walay mga node.30 Angay nga matikdan nga ang among mga resulta nagpakita usab nga ang benign nodules <6 mm ug ≥6 mm adunay taas nga pagkaparehas sa mga profile sa metabolismo, nga nagsugyot nga ang functional nga kahulugan sa benign etiology mao ang makanunayon bisan unsa pa ang gidak-on sa nodule.Busa, ang modernong diagnostic serum metabolite panels mahimong maghatag og usa ka assay isip rule-out nga pagsulay kung ang mga nodule sa sinugdan makita sa CT ug posibleng makunhuran ang serial monitoring.Sa samang higayon, ang sama nga panel sa metabolic biomarkers nagpalahi sa malignant nodules ≥6 mm ang gidak-on gikan sa benign nodules ug naghatag og tukma nga mga panagna alang sa mga IPN nga parehas nga gidak-on ug dili klaro nga morphological features sa CT nga mga hulagway.Kini nga serum metabolism classifier maayo nga nahimo sa pagtagna sa malignancy sa nodules ≥6 mm nga adunay AUC nga 0.927.Gikuha, ang among mga resulta nagpakita nga ang talagsaon nga serum metabolomic nga mga pirma mahimong espesipikong magpakita sa sayo nga mga pagbag-o sa metaboliko nga gipahinabo sa tumor ug adunay potensyal nga bili isip mga prediktor sa risgo, nga independente sa gidak-on sa nodule.
Ilabi na, ang lung adenocarcinoma (LUAD) ug squamous cell carcinoma (LUSC) mao ang mga nag-unang tipo sa non-small cell lung cancer (NSCLC).Gihatag nga ang LUSC kusganong nakig-uban sa paggamit sa tabako47 ug ang LUAD mao ang labing kasagaran nga histology sa mga incidental lung nodules nga nakita sa CT screening48, ang among classifier nga modelo espesipikong gihimo alang sa stage I nga mga sample sa adenocarcinoma.Gipunting usab ni Wang ug mga kauban ang LUAD ug giila ang siyam ka mga pirma sa lipid gamit ang lipidomics aron mailhan ang sayo nga yugto sa kanser sa baga gikan sa himsog nga mga indibidwal17.Gisulayan namo ang kasamtangan nga modelo sa classifier sa 16 ka mga kaso sa stage I LUSC ug 74 benign nodules ug naobserbahan ang ubos nga LUSC prediction accuracy (AUC 0.776), nga nagsugyot nga ang LUAD ug LUSC mahimong adunay ilang kaugalingong metabolomic signatures.Sa tinuud, ang LUAD ug LUSC gipakita nga lahi sa etiology, biological nga gigikanan ug genetic aberrations49.Busa, ang ubang mga matang sa histology kinahanglan nga ilakip sa mga modelo sa pagbansay alang sa pagtuki nga nakabase sa populasyon sa kanser sa baga sa mga programa sa screening.
Dinhi, nahibal-an namon ang unom nga labing kanunay nga giusab nga mga agianan sa adenocarcinoma sa baga kung itandi sa himsog nga mga kontrol ug mga benign nodules.Ang Xanthine ug hypoxanthine kay kasagarang mga metabolite sa purine metabolic pathway.Nahiuyon sa among mga resulta, ang mga intermediate nga may kalabutan sa purine metabolismo labi nga nadugangan sa serum o mga tisyu sa mga pasyente nga adunay adenocarcinoma sa baga kung itandi sa himsog nga mga kontrol o mga pasyente sa preinvasive nga yugto15,50.Ang taas nga lebel sa serum xanthine ug hypoxanthine mahimong magpakita sa anabolismo nga gikinahanglan sa paspas nga pagdaghan sa mga selula sa kanser.Ang dysregulation sa metabolismo sa glucose usa ka ilado nga timaan sa metabolismo sa kanser51.Dinhi, among naobserbahan ang usa ka mahinungdanon nga pagtaas sa pyruvate ug lactate sa LA nga grupo kumpara sa HC ug BN nga grupo, nga nahiuyon sa nangaging mga taho sa glycolytic pathway abnormalities sa serum metabolome profiles sa non-small cell lung cancer (NSCLC) nga mga pasyente ug himsog nga mga kontrol.ang mga resulta mao ang makanunayon52,53.
Importante, among naobserbahan ang usa ka balikbalik nga correlation tali sa pyruvate ug tryptophan metabolism sa serum sa baga adenocarcinomas.Ang lebel sa serum tryptophan mikunhod sa grupo sa LA kumpara sa grupo sa HC o BN.Makapainteres, ang usa ka miaging dako nga pagtuon gamit ang usa ka umaabot nga grupo nakit-an nga ang ubos nga lebel sa naglibot nga tryptophan nalangkit sa dugang nga risgo sa kanser sa baga 54.Ang Tryptophan usa ka hinungdanon nga amino acid nga makuha naton gikan sa pagkaon.Kami nakahinapos nga ang serum tryptophan depletion sa baga adenocarcinoma mahimong magpakita sa paspas nga pagkahurot niini nga metabolite.Nahibal-an nga ang katapusan nga produkto sa tryptophan catabolism pinaagi sa kynurenine pathway mao ang gigikanan sa de novo NAD + synthesis.Tungod kay ang NAD+ gihimo sa panguna pinaagi sa salvage pathway, ang kamahinungdanon sa NAD+ sa tryptophan metabolism sa kahimsog ug sakit nagpabilin nga matino46.Ang among pag-analisar sa database sa TCGA nagpakita nga ang pagpahayag sa tryptophan transporter solute transporter 7A5 (SLC7A5) dako nga nadugangan sa adenocarcinoma sa baga kumpara sa normal nga mga kontrol ug positibo nga may kalabutan sa pagpahayag sa glycolytic enzyme GAPDH.Ang mga nangaging mga pagtuon nag-una nga naka-focus sa papel sa tryptophan catabolism sa pagsumpo sa antitumor immune response40,41,42.Dinhi gipakita namon nga ang pagdili sa pag-uptake sa tryptophan pinaagi sa pag-knockdown sa SLC7A5 sa mga selula sa kanser sa baga nagresulta sa usa ka kasunod nga pagkunhod sa lebel sa cellular NAD ug usa ka dungan nga pagkunhod sa kalihokan sa glycolytic.Sa katingbanan, ang among pagtuon naghatag usa ka biolohikal nga sukaranan alang sa mga pagbag-o sa metabolismo sa serum nga may kalabotan sa malignant nga pagbag-o sa adenocarcinoma sa baga.
Ang mutation sa EGFR mao ang labing kasagaran nga mutation sa drayber sa mga pasyente nga adunay NSCLC.Sa among pagtuon, nakit-an namon nga ang mga pasyente nga adunay mutation sa EGFR (n = 41) adunay kinatibuk-ang mga profile sa metabolomic nga susama sa mga pasyente nga adunay wild-type nga EGFR (n = 31), bisan kung nakit-an namon ang pagkunhod sa lebel sa serum sa pipila nga mga pasyente nga mutant sa EGFR sa mga pasyente nga acylcarnitine.Ang natukod nga function sa acylcarnitines mao ang pagdala sa mga acyl nga grupo gikan sa cytoplasm ngadto sa mitochondrial matrix, nga mosangpot sa oksihenasyon sa fatty acids aron makahimo og enerhiya 55.Nahiuyon sa among mga nahibal-an, usa ka bag-o nga pagtuon usab nagpaila sa parehas nga mga profile sa metabolome tali sa EGFR mutant ug EGFR wild-type nga mga tumor pinaagi sa pag-analisar sa global nga metabolome sa 102 nga mga sample sa tisyu sa adenocarcinoma sa baga50.Makaiikag, ang acylcarnitine content nakit-an usab sa EGFR mutant group.Busa, kung ang mga pagbag-o sa lebel sa acylcarnitine nagpakita sa mga pagbag-o sa metaboliko nga gipahinabo sa EGFR ug ang nagpahiping mga agianan sa molekula mahimong takus sa dugang nga pagtuon.
Sa konklusyon, ang among pagtuon nagtukod og serum metabolic classifier alang sa differential diagnosis sa pulmonary nodules ug nagsugyot og workflow nga maka-optimize sa risk assessment ug mapadali ang clinical management base sa CT scan screening.
Kini nga pagtuon giaprobahan sa Ethics Committee sa Sun Yat-sen University Cancer Hospital, sa First Affiliated Hospital sa Sun Yat-sen University, ug sa Ethics Committee sa Zhengzhou University Cancer Hospital.Sa discovery ug internal validation nga mga grupo, 174 sera gikan sa himsog nga mga indibidwal ug 244 sera gikan sa benign nodules ang nakolekta gikan sa mga indibidwal nga gipailalom sa tinuig nga medikal nga eksaminasyon sa Department of Cancer Control and Prevention, Sun Yat-sen University Cancer Center, ug 166 benign nodules.serum.Ang Stage I nga lung adenocarcinomas nakolekta gikan sa Sun Yat-sen University Cancer Center.Sa external validation cohort, adunay 48 ka kaso sa benign nodules, 39 ka kaso sa stage I lung adenocarcinoma gikan sa First Affiliated Hospital sa Sun Yat-sen University, ug 24 ka kaso sa stage I lung adenocarcinoma gikan sa Zhengzhou Cancer Hospital.Ang Sun Yat-sen University Cancer Center nagkolekta usab og 16 ka kaso sa stage I squamous cell lung cancer aron sulayan ang diagnostic nga abilidad sa natukod nga metabolic classifier (mga kinaiya sa pasyente gipakita sa Supplementary Table 5).Ang mga sample gikan sa discovery cohort ug internal validation cohort nakolekta tali sa Enero 2018 ug Mayo 2020. Ang mga sample alang sa external validation cohort gikolekta tali sa Agosto 2021 ug Oktubre 2022. Aron mamenosan ang gender bias, gibana-bana nga managsama nga gidaghanon sa mga kaso sa lalaki ug babaye ang gi-assign sa matag usa grupo.Discovery Team ug Internal Review Team.Ang gender sa partisipante gitino base sa self-report.Ang gipahibalo nga pagtugot nakuha gikan sa tanan nga mga partisipante ug walay bayad nga gihatag.Ang mga subject nga adunay benign nodules mao kadtong adunay stable nga CT scan score sa 2 ngadto sa 5 ka tuig sa panahon sa pagtuki, gawas sa 1 nga kaso gikan sa external validation sample, nga nakolekta sa wala pa ang operasyon ug nadayagnos sa histopathology.Gawas sa laygay nga bronchitis.Ang mga kaso sa adenocarcinoma sa baga gikolekta sa wala pa ang resection sa baga ug gikumpirma sa pathological diagnosis.Ang mga sample sa dugo sa pagpuasa gikolekta sa serum separation tubes nga walay bisan unsang anticoagulants.Ang mga sample sa dugo gi-clot sa 1 ka oras sa temperatura sa kwarto ug dayon gi-centrifuge sa 2851 × g sa 10 minuto sa 4 ° C aron makolekta ang serum supernatant.Ang mga aliquot sa serum gi-frozen sa -80 ° C hangtod makuha ang metabolite.Ang Departamento sa Paglikay sa Kanser ug Pagsusi sa Medisina sa Sun Yat-sen University Cancer Center nangolekta ug usa ka pool sa serum gikan sa 100 ka himsog nga mga donor, lakip ang managsama nga gidaghanon sa mga lalaki ug babaye nga nag-edad 40 hangtod 55 ka tuig.Ang parehas nga gidaghanon sa matag sample sa donor gisagol, ang resulta nga pool gi-aliquote ug gitipigan sa -80 ° C.Ang sagol nga serum gigamit ingon nga materyal nga pakisayran alang sa pagkontrol sa kalidad ug pag-standardize sa datos.
Ang reperensiya nga serum ug mga sample sa pagsulay gitunaw ug ang mga metabolite gikuha gamit ang usa ka hiniusa nga pamaagi sa pagkuha (MTBE / methanol / tubig) 56.Sa mubo, 50 μl sa serum gisagol sa 225 μl sa ice-cold methanol ug 750 μl sa ice-cold methyl tert-butyl ether (MTBE).Pagpalihok sa sagol ug paglumlum sa yelo sulod sa 1 ka oras.Ang mga sample dayon gisagol ug vortex nga gisagol sa 188 μl nga MS-grade nga tubig nga adunay sulud nga sulud sa sulud (13C-lactate, 13C3-pyruvate, 13C-methionine, ug 13C6-isoleucine, gipalit gikan sa Cambridge Isotope Laboratories).Ang sagol nga dayon centrifuged sa 15,000 × g alang sa 10 min sa 4 ° C, ug ang ubos nga bahin gibalhin ngadto sa duha ka tubo (125 μL matag usa) alang sa LC-MS analysis sa positibo ug negatibo nga mga paagi.Sa katapusan, ang sampol gipahubas sa pagkauga sa usa ka high-speed vacuum concentrator.
Ang mga uga nga metabolite gi-reconstituted sa 120 μl nga 80% acetonitrile, gi-vortex sa 5 min, ug gi-centrifuged sa 15,000 × g sa 10 min sa 4 ° C.Ang mga supernatant gibalhin ngadto sa amber glass nga mga panaksan nga adunay mga microinsert alang sa mga pagtuon sa metabolomics.Ang wala gipunting nga metabolomics analysis sa usa ka ultra-performance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) nga plataporma.Ang mga metabolite gibulag gamit ang Dionex Ultimate 3000 UPLC system ug usa ka ACQUITY BEH Amide column (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters).Sa positive ion mode, ang mga mobile phase mao ang 95% (A) ug 50% acetonitrile (B), ang matag usa adunay 10 mmol/L ammonium acetate ug 0.1% formic acid.Sa negatibo nga mode, ang mga mobile phase A ug B adunay 95% ug 50% acetonitrile, matag usa, ang duha nga mga hugna adunay 10 mmol / L ammonium acetate, pH = 9. Ang gradient nga programa mao ang mosunod: 0-0.5 min, 2% B;0.5–12 min, 2–50% B;12–14 min, 50–98% B;14–16 min, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16.1-20 min, 2% B. Ang kolum gipadayon sa 40 ° C ug ang sample sa 10 ° C sa autosampler.Ang rate sa pag-agos mao ang 0.3 ml / min, ang gidaghanon sa indeyksiyon mao ang 3 μl.Usa ka Q-Exactive Orbitrap mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) nga adunay electrospray ionization (ESI) nga tinubdan ang gipadagan sa full scan mode ug giubanan sa ddMS2 monitoring mode aron makolekta ang dagkong volume sa datos.Ang mga parameter sa MS gitakda sama sa mosunod: spray voltage +3.8 kV/- 3.2 kV, capillary temperature 320°C, shielding gas 40 arb, auxiliary gas 10 arb, probe heater temperature 350°C, scanning range 70–1050 m/h, resolusyon.70 000. Nakuha ang datos gamit ang Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Aron masusi ang kalidad sa datos, ang mga sample nga gi-pool nga quality control (QC) gihimo pinaagi sa pagtangtang sa 10 μL nga mga aliquot sa supernatant gikan sa matag sample.Unom ka kalidad nga pagkontrol sa sample injection ang gisusi sa sinugdanan sa analytical sequence aron masusi ang kalig-on sa UPLC-MS system.Ang mga sample sa pagkontrol sa kalidad kanunay nga gipaila sa batch.Ang tanan nga 11 ka batch sa mga sample sa serum niini nga pagtuon gisusi sa LC-MS.Ang mga aliquots sa usa ka serum pool mixture gikan sa 100 ka himsog nga mga donor gigamit isip reference material sa tagsa-tagsa ka mga batch aron mamonitor ang proseso sa pagkuha ug adjust para sa batch-to-batch effects.Ang untargeted metabolomics analysis sa discovery cohort, internal validation cohort, ug external validation cohort gihimo sa Metabolomics Center sa Sun Yat-sen University.Ang gawas nga laboratoryo sa Guangdong University of Technology Analysis and Testing Center nag-analisar usab sa 40 ka mga sample gikan sa external cohort aron sulayan ang performance sa classifier model.
Human sa pagkuha ug pag-reconstitution, ang hingpit nga quantitation sa serum metabolites gisukod gamit ang ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (Agilent 6495 triple quadrupole) nga adunay electrospray ionization (ESI) nga tinubdan sa multiple reaction monitoring (MRM) mode.Usa ka ACQUITY BEH Amide column (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) gigamit sa pagbulag sa mga metabolite.Ang mobile phase naglangkob sa 90% (A) ug 5% acetonitrile (B) nga adunay 10 mmol/L ammonium acetate ug 0.1% ammonia solution.Ang gradient nga programa mao ang mosunod: 0–1.5 min, 0% B;1.5–6.5 min, 0–15% B;6.5–8 min, 15% B;8–8.5 min, 15%–0% B;8.5–11.5 ka min, 0%B.Ang kolum gipadayon sa 40 °C ug ang sample sa 10 °C sa autosampler.Ang rate sa pag-agos mao ang 0.3 mL / min ug ang gidaghanon sa indeyksiyon mao ang 1 μL.Ang mga parameter sa MS gitakda sama sa mosunod: capillary voltage ± 3.5 kV, nebulizer pressure 35 psi, sheath gas flow 12 L/min, sheath gas temperature 350°C, drying gas temperature 250°C, ug drying gas flow 14 l/min.Ang mga pagbag-o sa MRM sa tryptophan, pyruvate, lactate, hypoxanthine ug xanthine mao ang 205.0-187.9, 87.0-43.4, 89.0-43.3, 135.0-92.3 ug 151.0-107.9 matag usa.Gikolekta ang datos gamit ang Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Alang sa mga sample sa serum, ang tryptophan, pyruvate, lactate, hypoxanthine, ug xanthine gi-quantified gamit ang calibration curves sa standard mixture solutions.Alang sa mga sample sa cell, ang sulud sa tryptophan gi-normalize sa sulud sa sulud ug masa sa protina sa cell.
Ang peak extraction (m/z ug retention time (RT)) gihimo gamit ang Compound Discovery 3.1 ug TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Aron mawagtang ang potensyal nga mga kalainan tali sa mga batch, ang matag kinaiya nga peak sa sample sa pagsulay gibahin sa kinaiya nga peak sa reference nga materyal gikan sa samang batch aron makuha ang paryente nga kadagaya.Ang relatibong standard deviations sa internal nga mga sumbanan sa wala pa ug human sa standardization gipakita sa Supplementary Table 6. Ang mga kalainan tali sa duha ka grupo gihulagway pinaagi sa bakak nga pagkadiskobre nga rate (FDR<0.05, Wilcoxon signed rank test) ug fold change (>1.2 o <0.83).Ang hilaw nga datos sa MS sa mga nakuha nga bahin ug reference serum-corrected MS data gipakita sa Supplementary Data 1 ug Supplementary Data 2, matag usa.Ang peak annotation gihimo base sa upat ka gihubit nga lebel sa pag-ila, lakip ang giila nga metabolites, putatively annotated compounds, putatively characterized compound classes, ug wala mailhi nga mga compound 22.Base sa database searches sa Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), biological compounds nga may MS/MS matching validated standards o exact match annotation sa mzCloud (score > 85) o Chemspider sa kataposan napili isip intermediate tali sa differential metabolome.Ang peak annotation alang sa matag feature gilakip sa Supplementary Data 3. MetaboAnalyst 5.0 gigamit alang sa univariate analysis sa sum-normalized metabolite abundance.Ang MetaboAnalyst 5.0 usab nag-evaluate sa KEGG pathway enrichment analysis base sa lain-laing mga metabolites.Ang principal component analysis (PCA) ug partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) gisusi gamit ang ropls software package (v.1.26.4) nga adunay stack normalization ug autoscaling.Ang labing maayo nga metabolite biomarker nga modelo alang sa pagtagna sa nodule malignancy namugna gamit ang binary logistic regression nga adunay pinakagamay nga absolute shrinkage ug selection operator (LASSO, R package v.4.1-3).Ang performance sa discriminant model sa detection ug validation sets gihulagway pinaagi sa pagbanabana sa AUC base sa ROC analysis sumala sa pROC package (v.1.18.0.).Ang labing maayo nga kalagmitan cutoff nakuha base sa maximum Youden index sa modelo (sensitivity + specificity - 1).Ang mga sampol nga adunay mga kantidad nga gamay o labi pa sa threshold matagna ingon mga benign nodules ug adenocarcinoma sa baga, matag usa.
A549 cells (#CCL-185, American Type Culture Collection) gipatubo sa F-12K medium nga adunay 10% FBS.Ang mubo nga hairpin RNA (shRNA) nga mga han-ay nga nagpunting sa SLC7A5 ug usa ka nontargeting control (NC) gisulod sa lentiviral vector pLKO.1-puro.Ang antisense sequence sa shSLC7A5 mao ang mosunod: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).Ang mga antibodies sa SLC7A5 (#5347) ug tubulin (#2148) gipalit gikan sa Cell Signaling Technology.Ang mga antibodies sa SLC7A5 ug tubulin gigamit sa usa ka dilution nga 1: 1000 alang sa Western blot analysis.
Ang Seahorse XF Glycolytic Stress Test nagsukod sa lebel sa extracellular acidification (ECAR).Sa assay, glucose, oligomycin A, ug 2-DG ang gipangalagad nga sunud-sunod aron sulayan ang cellular glycolytic nga kapasidad nga gisukod sa ECAR.
Ang mga selula sa A549 nga gibalhin nga adunay kontrol nga dili target (NC) ug shSLC7A5 (Sh1, Sh2) giputos sa tibuok gabii sa 10 cm diameter nga mga pinggan.Ang mga metabolite sa cell gikuha gamit ang 1 ml nga bugnaw nga yelo nga 80% nga adunay tubig nga methanol.Ang mga selula sa solusyon sa methanol gikuha, gikolekta sa usa ka bag-ong tubo, ug gi-centrifuge sa 15,000 × g sulod sa 15 min sa 4°C.Pagkolekta og 800 µl nga supernatant ug uga gamit ang high-speed vacuum concentrator.Ang uga nga metabolite pellets gisusi dayon alang sa lebel sa tryptophan gamit ang LC-MS/MS sama sa gihulagway sa ibabaw.Ang lebel sa cellular NAD(H) sa A549 cells (NC ug shSLC7A5) gisukod gamit ang quantitative NAD+/NADH colorimetric kit (#K337, BioVision) sumala sa mga instruksyon sa tiggama.Ang lebel sa protina gisukod alang sa matag sample aron ma-normalize ang gidaghanon sa mga metabolite.
Wala'y gigamit nga mga pamaagi sa istatistika aron mahibal-an ang gidak-on sa sample.Ang nangaging mga pagtuon sa metabolomics nga gitumong sa biomarker discovery15,18 giisip nga mga benchmark alang sa gidak-on nga determinasyon, ug kon itandi niini nga mga taho, ang among sample igo na.Wala’y mga sampol nga wala iapil sa cohort sa pagtuon.Ang mga sample sa serum random nga gi-assign sa usa ka grupo sa pagkadiskobre (306 nga mga kaso, 74.6%) ug usa ka internal nga validation nga grupo (104 nga mga kaso, 25.4%) alang sa wala gipunting nga mga pagtuon sa metabolomics.Gipili usab namo nga random ang 70 ka mga kaso gikan sa matag grupo gikan sa nadiskobrehan nga set alang sa gitumong nga mga pagtuon sa metabolomics.Ang mga imbestigador nabuta sa buluhaton sa grupo sa panahon sa pagkolekta ug pagtuki sa datos sa LC-MS.Ang mga pag-analisa sa estadistika sa datos sa metabolomics ug mga eksperimento sa selula gihulagway sa tagsa-tagsa nga mga Resulta, Figure Legends, ug Mga pamaagi nga seksyon.Ang pag-ihap sa cellular tryptophan, NADT, ug glycolytic nga kalihokan gihimo tulo ka beses nga independente nga adunay parehas nga mga sangputanan.
Alang sa dugang nga impormasyon bahin sa disenyo sa pagtuon, tan-awa ang Natural Portfolio Report Abstract nga nalangkit niini nga artikulo.
Ang hilaw nga datos sa MS sa mga nakuha nga bahin ug ang normal nga data sa MS sa reference serum gipakita sa Supplementary Data 1 ug Supplementary Data 2, matag usa.Ang peak annotation para sa differential features gipresentar sa Supplementary Data 3. Ang LUAD TCGA dataset mahimong ma-download gikan sa https://portal.gdc.cancer.gov/.Ang input data alang sa pagplano sa graph gihatag sa tinubdan data.Ang tinubdan data gihatag alang niini nga artikulo.
Nasyonal nga Lung Screening Study Group, ug uban pa. Pagminus sa pagkamatay sa kanser sa baga gamit ang ubos nga dosis nga computed tomography.Amihanang England.J. Med.365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR ug Propeta, PC Lung cancer screening gamit ang low-dose helical CT: resulta gikan sa National Lung Screening Study (NLST).J. Med.Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, ug uban pa.Ang pagkunhod sa pagkamatay sa kanser sa baga nga adunay volumetric CT screening sa usa ka random nga pagsulay.Amihanang England.J. Med.382, 503–513 (2020).
Oras sa pag-post: Sep-18-2023