Ang Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) usa ka third-generation genome editing technique nga nakapausab sa kalibutan pinaagi sa high-throughput results niini. Gigamit kini sa pagtambal sa nagkalain-laing biological nga mga sakit ug impeksyon. Ang nagkalain-laing bacteria ug uban pang prokaryotes (sama sa archaea) adunay usab CRISPR/Cas9 systems aron depensahan batok sa mga phage. Gikataho nga ang mga estratehiya nga nakabase sa CRISPR/Cas9 makapugong sa pagtubo ug pag-uswag sa triple negative breast cancer (TNBC) pinaagi sa pag-target sa mga potensyal nga nausab nga resistance genes, transcription, ug epigenetic regulation. Kini nga mga therapeutic interventions makatabang sa pagsulbad sa mga mahagiton nga problema sama sa drug resistance nga naobserbahan bisan sa TNBC. Sa pagkakaron, lain-laing mga pamaagi ang gigamit aron mahatud ang CRISPR/Cas9 sa mga target nga cells, sama sa physical (microinjection, electroporation ug hydrodynamic modes), viral (adeno-associated virus ug lentivirus) ug non-viral (liposomes ug lipid nanoparticles). )-particles). Bisan pa man og lain-laing mga modelo ang naugmad aron tun-an ang mga molekular nga hinungdan sa TNBC, ang kakulang sa sensitibo ug gipunting nga mga pamaagi alang sa paghatud sa mga himan sa pag-edit sa genome in vivo naglimite sa ilang klinikal nga aplikasyon. Sa kinatibuk-an, kini nga pagrepaso komprehensibo nga nagsusi sa pag-uswag, mga hagit, mga limitasyon, ug mga palaaboton sa pagtambal sa CRISPR/Cas9 alang sa TNBC base sa kasamtangang ebidensya. Gipasiugda usab namo kung giunsa ang kombinasyon sa artipisyal nga paniktik ug machine learning makapauswag sa mga estratehiya sa CRISPR/Cas9 sa pagtambal sa TNBC.
Ang kanser mailhan pinaagi sa dili makontrol nga pagbahin sa selula, pagkabalda sa mga checkpoint sa siklo sa selula, ug mga mutasyon sa mga tumor suppressor gene (TSG) (Matthews et al., 2022). Taliwala sa lainlaing mga klase sa kanser, ang kanser sa suso mao ang labing komon nga klase sa kanser sa mga babaye ug adunay taas nga rate sa pagkamatay sa tibuuk kalibutan (Waks ug Winer, 2019). Ang kanser sa suso usa ka heterogeneous nga sakit nga adunay lainlaing mga kinaiya, sama sa histological ug biological nga mga bahin, klinikal nga presentasyon ug pamatasan, ug tubag sa pagtambal (Weigelt et al., 2010). Ang klasipikasyon sa kanser sa suso naghatag ug tukma nga mga panabut alang sa pagdayagnos sa kanser sa suso ug prognosis sa tumor. Ang paggamit sa mga komon nga biomarker ug mga klinikal nga bahin sa klinika mao ang panguna nga sukdanan alang sa klasipikasyon sa kanser sa suso (Tsang ug Tse, 2019). Ang prognosis ug tubag sa pagtambal sa kanser sa suso naimpluwensyahan sa daghang mga hinungdan, lakip ang presensya sa estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), human epidermal growth factor receptor 2 (HER2/neu), ug histological grade, tipo sa tumor, ug grado. gidak-on ug lymph node metastasis (Al-Tubaiti, 2020). Lima ka intrinsic molecular subtypes sa kanser sa suso ang nailhan, lakip ang luminal A, luminal B, HER2-enriched, basal-like, ug claudin-low (Prat et al., 2015). Ang TNBC usa ka molecular subtype sa kanser nga dili mopahayag sa tanang ER, PR, ug HER2 (Yin et al., 2020). Kini nga mga pathological features nalangkit sa TNBC, nga nagpamatuod sa paspas nga pag-uswag ug mas agresibo nga kinaiya niini kaysa bisan unsang ubang klase sa kanser sa suso (Feng et al., 2018). Dugang pa, si Peru et al (2000) migamit og microarray technology aron i-reclassify ang kanser sa suso ug mailhan ang lima ka intrinsic subtypes sa kanser sa suso (Cadenas, 2012). Ang basal-like breast cancer usa ka subtype sa kanser sa suso nga adunay triple-negative phenotype ug nalangkit sa paspas nga pag-uswag. Kinahanglan nga matikdan nga ang tanan nga basal-like breast cancers kasagarang masayop nga nadayagnos nga TNBC, apan 77% ra ang TNBC; Sa kasukwahi, 71–91% sa TNBC kay basal-like, nga nagpakita nga kining duha ka klase sa kanser sa suso nagsapaw ug nagrepresentar sa lain-laing klasipikasyon (Wang D.-Y. et al., 2019). Kini nagmugna og panginahanglan sa pag-ila sa heterogeneity sa TNBC aron maklaro ang prognosis ug mailhan ang posibleng mga tubag sa karon ug sa umaabot nga mga pagtambal. Dugang pa, ang TNBC nagkantidad og 15–20% sa tanang kaso sa kanser sa suso ug mas komon sa mga babaye nga ubos sa 50 anyos. Ang mga mutasyon sa BRCA1 o BRCA2 gitaho sa gibana-bana nga 20% sa mga kaso sa TNBC (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017). , 2020). Gipakita usab sa mga pagtuon nga ang TNBC adunay lahi nga immune microenvironment nga naglakip sa taas nga lebel sa vascular endothelial growth factors, tumor-associated macrophages (TAMs), tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), ug uban pang mga molekula nga nalambigit sa pagtubo ug pagbalhin sa tumor. Busa, ang pagsabot sa microenvironment sa TNBC importante kaayo para sa prognosis ug pagtambal niini (Fan ug He, 2022).
Aron masusi ang prognosis sa TNBC ug masiguro ang epektibo nga pagtambal, importante ang tukmang diagnosis, nga gibase sa immunohistochemistry (IHC) aron mahibal-an ang ER, PR ug HER2, ug mammography aron mahibal-an ang mga neoplasma sa suso. Bisan pa, ang mammography dili igo nga makapakita sa mga intratumoral nga bahin sama sa necrosis ug fibrosis (Deepak Singh et al., 2021). Tungod kay ang dili maayo nga prognosis ug diagnosis makapugong sa mga doktor sa pagreseta sa husto nga mga tambal (Chaudhary, 2020), lainlaing mga estratehiya ang gigamit aron mapaayo ang pag-atiman sa mga pasyente nga adunay TNBC. Sa pagkakaron, duha ka tambal, ang doxorubicin ug cyclophosphamide, ang gigamit sa mga pasyente nga adunay TNBC ug nagpakita og maayong mga resulta. Dugang pa, gigamit ang ubang mga platinum nga tambal, sama sa carboplatin ug cisplatin (Sikov et al., 2015). Dugang pa, ang mga PARP inhibitor sama sa Olaparib, Velaparib, ug PF-01367338 gigamit isip potensyal nga mga tambal sa chemotherapy alang sa pagtambal sa TNBC (Ishino et al., 2018). Tungod kay ang Wnt/b-Catenin, NOTCH, ug Hedgehog signaling pathways gikataho nga nalambigit sa pagkahitabo ug pag-uswag sa TNBC, ang pag-target sa mga tambal niini nga mga pathway mahimong usa ka importante nga estratehiya (Aysola et al., 2013). Bisan tuod ang operasyon, radiation therapy ug chemotherapy nagpabilin nga pangunang tambal sa TNBC karon, dako nga pag-uswag ang nahimo sa pagpalambo sa bag-ong mga pagtambal lakip ang targeted therapy, immunotherapy, lain-laing mga himan sa pag-edit sa gene nga may kalabutan sa CRISPR sama sa Cas9n, dCas9., CRISPR/Cas12, prime editing, ug CRISPR/Cas9-targeted gene therapy. Dinhi atong tutokan ang lain-laing mga himan sa pag-edit sa gene nga may kalabutan sa CRISPR nga gigamit sa pagtambal sa TNBC. Lakip niini, ang CRISPR/Cas9 nakadawat og kaylap nga atensyon.
Ang Cas9n, nailhan usab nga Cas9 nickase, usa ka genetically engineered nga variant sa Cas9 protein nga nakuha gikan sa CRISPR/Cas9 genome editing system (Gupta et al., 2019). Sa orihinal nga porma niini, ang Cas9 protein adunay duha ka nuclease domain: RuvC ug HNH, ang pangunang gimbuhaton niini mao ang pagbahin sa duha ka DNA strands. Bisan pa, sa Cas9n, usa sa mga nuclease domain, ang HNH, genetically mutated ug nahimong dili aktibo. Busa, ang HNH domain sa Cas9n nagpabilin nga dili molihok. Ang RuvC domain lamang ang nagpabilin nga aktibo, nga nagtugot sa Cas9n sa pagputol o paghimo og mga break sa single DNA strands (Trevino ug Zhang, 2014). Kung itandi sa Cas9, ang Cas9n epektibo nga makapakunhod sa mga off-target nga epekto ug tukma nga makapauswag sa mga mekanismo sa pag-ayo sa cell. Ang Cas9n magamit sa pagsulbad sa lainlaing mga problema, sama sa paghimo og mga break sa piho nga mga lokasyon sa double-stranded DNA. Alang niini nga katuyoan, duha ka Cas9n molecule ang gihiusa ug gigamit nga magkauban (Yee, 2016). Ang mixed lineage kinase 3 (MLK3) usa ka mitogen-activated protein kinase nga nagsilbing importanteng regulator atol sa TNBC metastasis (Cronan et al., 2012).
Ang MLK3 maka-activate sa daghang signaling pathways nga mosangpot sa TNBC metastasis. Pananglitan, ang c-Jun N-terminal kinase (JNK) pathway nag-regulate sa cell motility ug extracellular matrix degradation, ug ang MLK3 nag-activate sa JNK pathway, sa ingon nagpalambo sa cell motility ug naghatag og invasive properties (Rattanasinchai ug Gallo, 2016). Ang MLK3 nag-regulate usab sa EMT. Aron mahimo kini, gi-activate niini ang downstream transcription factors sama sa Snail, Slug ug Twist. Kini nga mga factor nagpugong sa expression sa epithelial markers ug nagpasiugda sa expression sa mesenchymal markers, nga mosangpot sa pag-angkon sa metastatic phenotype (Casalino et al., 2023). Ang MLK3 naobserbahan nga adunay papel sa ECM remodeling ug activation sa mga protease sama sa matrix metalloproteinases (MMPs) nga nagdaot sa ECM. Kini nagpadali sa pagsulong sa tumor cell ug pagkaylap sa lagyong mga lugar (Katari et al., 2019). Busa, ang nangaging mga pagtuon nagpakita nga ang MLK3 adunay kritikal nga papel sa TNBC. Gigamit nila ni Rattanasinchai ug Gallo ang mga modelo sa TNBC aron tun-an ang papel sa MLK3 ug nakit-an nga kini nagpasiugda sa paglambo sa kanser pinaagi sa piho nga mga agianan sa signaling. Gigamit nila ang CRISPR/Cas9n aron ma-edit ang MLK3 ug nakamatikod sa usa ka hinungdanon nga pagkunhod sa metastasis sa TNBC (Rattanasinchai ug Gallo, 2016).
Ang dCas9, nga sagad gitawag nga inactive Cas9, usa ka giusab nga derivative nga porma sa Cas9 protein. Dili sama sa aktibo nga Cas9, ang dCas9 kulang sa endonuclease activity, nga naghimo niini nga dili maka-induce sa DNA double-strand breaks. Busa, ang dCas9 magamit aron tukma nga ma-target ang piho nga mga rehiyon sa genome nga wala’y bisan unsang mga pagbag-o o pag-usab sa DNA sequence (Wang et al., 2016). Sa dCas9, duha ka endonuclease protein, RuvC ug HNH, ang gi-inactivate pinaagi sa pagpugong sa hinungdanon nga amino acid residues. (Richter et al., 2016). Bisan pa sa kakulang niini sa DNA cleavage activity, ang dCas9 adunay daghang hinungdanon nga papel sa genetic research ug biotechnology. Pananglitan, gitugotan niini ang pagtan-aw sa piho nga mga rehiyon sa genome, gipadali ang transcriptional regulation, ug nagpasiugda sa epigenetic modifications (Brocken et al., 2018).
Ang transcription factor nga ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) adunay espesipiko ug kritikal nga papel sa pagpataliwala sa epithelial-mesenchymal transition (EMT), usa ka proseso sa cellular nga mahitabo atol sa embryonic development, pag-ayo sa tisyu, ug pag-uswag sa kanser. Naglambigit kini sa pagbag-o sa mga epithelial cells ngadto sa mesenchymal cells, nga moresulta sa mga pagbag-o sa morphology sa cell, motility, invasiveness, ug uban pa. (Wu et al., 2020). Ang ZEB1 nagpugong sa daghang epithelial markers, sama sa E-cadherin ug Occludin, nga responsable sa pagmintinar sa cell-cell adhesion ug polarity sa mga epithelial cells sa TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Dugang pa, ang ZEB1 nag-activate sa pipila ka mga marker sama sa N-cadherin, vimentin ug fibronectin (Konradi et al., 2014) ug nag-regulate usab sa mga gene nga nalambigit sa cytoskeletal remodeling sama sa Rho GTPases ug matrix metalloproteinases (MMPs) (Huang). et al., 2014). 2022), dugang pa, makaapekto usab kini sa lain-laing mga signaling pathways sama sa transforming growth factor-β (TGF-β), Wnt signaling, ug uban pa, sa ingon nagpasiugda sa pagsulong sa tumor ug metastasis sa TNBC (Chen et al., 2016). Daghang mga pagtuon ug siyentipikong ebidensya ang nagpakita nga ang ZEB1 adunay dakong potensyal isip usa ka bililhong ahente alang sa pag-ila ug therapeutic intervention sa TNBC. Sa usa ka bag-o nga pagtuon, si Waryah et al. migamit og TNBC model ug nakab-ot ang kompleto nga pagpugong sa ZEB1 pinaagi sa dCas9. Busa, ilang naobserbahan ang taas kaayo nga specificity ug halos kompleto nga pagpugong sa ZEB1 sa mga kondisyon nga in vivo (Waryah et al., 2023).
Ang CRISPR/Cas12 usa ka himan sa pag-edit sa gene nga gitawag og CRISPR/Cpf1. Kini gikuha gikan sa sistema sa CRISPR/Cas, diin ang termino nga Cas12 nagtumong sa CRISPR-associated protein 12 (Bharathkumar et al., 2022), nga hingpit nga susama sa Cas9. Ang bugtong kalainan mao nga kini adunay protina nga Cas12. Kung itandi sa Cas9, ang Cas12 adunay pipila ka talagsaon nga mga gimbuhaton sama sa paghimo og sticky ends atol sa proseso sa pag-edit sa gene, samtang ang Cas9 nagmugna og blunt ends (Wang et al., 2021). Kini nga kabtangan sa Cas12 nakatampo sa piho nga teknolohiya sa pagmaniobra sa DNA. Isip usa ka protina nga makahimo sa tukma nga pag-ila ug pagputol sa target nga DNA, kini adunay talagsaon nga pagka-flexible, nga naghimo niini nga usa ka epektibo nga himan alang sa lainlaing mga aplikasyon, lakip ang pag-edit sa gene (Pickar-Oliver ug Gersbach, 2019).
Sama sa ubang mga variant sa CRISPR, ang CRISPR/Cas12 makahimo usab sa pag-knockout o pag-activate sa mga gene sa TNBC, nga nagtumong sa mga gene nga adunay importanteng papel sa pathogenesis o tubag niini sa pagtambal (Yang ug Zhang, 2023). Aron mahimo kini nga proseso, usa ka guide RNA (gRNA) ang gihimo nga nagdirekta sa Cas12 ngadto sa target gene. Sa higayon nga ang Cas12 motapot sa target niini, kini magpaila sa double-strand breaks sa DNA ug mo-activate sa mga mekanismo sa pag-ayo sa DNA. Atol sa proseso sa pag-ayo, ang dili husto nga mga nucleotide mahimong ilakip, nga mosangpot sa mga mutasyon sa gene ug pagkawala sa function (Zhang et al., 2021a). Dugang pa, usa ka gipauswag nga bersyon sa Cas12 enzyme (gitawag og dCas12) ang gigamit usab sa pag-activate sa mga gene. Pinaagi sa paghiusa niini sa usa ka transcription activator, posible nga ma-induce ang pipila ka mga gene, sa ingon ma-activate kini. Kini nga teknolohiya adunay dako nga potensyal sa pagpasiugda sa pag-activate sa mga tumor suppressor gene (Sultan et al., 2022).
Ang prime editing usa ka bag-ong naugmad ug labi ka maayo nga teknolohiya sa pag-edit sa genome. Kini makahimo sa pag-usab sa DNA sa usa ka organismo nga tukma kaayo (Chen ug Liu, 2023). Ang prime editing makab-ot pinaagi sa paghiusa sa duha ka nag-unang sangkap: usa ka giusab nga CRISPR/Cas9 enzyme ug reverse transcriptase. Ang papel sa CRISPR/Cas9 enzyme mao ang pagpili sa tukma nga mga site sa genome, samtang ang reverse transcriptase makatabang sa hingpit nga pag-usab sa DNA sa target nga lokasyon (Hassan et al., 2021). Sa mekanismo sa primer editing, ang unang lakang naglakip sa paghimo og primer editing guide RNA (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). Naglangkob kini sa target sequence ug RNA template nga katumbas sa gitinguha nga editing site sa target nga DNA. Ang pegRNA dayon gipaila sa mga target cell uban sa primer editing nuclease (PE2). Ang PE2 usa ka fusion protein nga gilangkoban sa Cas9 enzyme, reverse transcriptase, ug primer editing adapter (Martín-Alonso et al., 2021). Sulod sa selula, ang pegRNA ug PE2 complexes mangita sa espesipikong DNA nga gusto nilang usbon. Ang Cas9 enzyme moputol sa DNA ug mohimo og template nga gilangkoban sa single strands (Choi et al., 2022). Ang reverse transcriptase mogamit niini nga template aron maandam ang DNA alang sa pag-edit. Gawas sa pagkopya sa DNA, gilakip usab ang mga instruksyon alang sa pag-edit sa RNA template. Sa katapusan, ang bag-ong gibuhat nga DNA strand gigamit isip template aron ayohon ang pagkaguba sa DNA, nga moresulta sa usa ka giusab nga DNA sequence nga adunay gitinguha nga pagbag-o (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Ang mga mekanismo sa primer editing mahimong mosangpot sa kaylap nga mga mutasyon sa mga gene. Mahimo niini nga target ang mga point mutations, insertions, deletions, ug bisan ang mga gene replacements (Anzalone et al., 2019; Chen ug Liu, 2023). Ang prime editing nagtanyag og daghang mga bentaha kaysa sa nangaging mga teknolohiya sa pag-edit sa genome. Naglakip kini sa dugang nga katukma, pagkunhod sa mga off-target nga epekto, ug ang abilidad sa pag-edit sa DNA nga wala magsalig sa DNA double-strand breaks (Anzalone et al., 2020).
Ang teknolohiya sa CRISPR/Cas9 orihinal nga naugmad aron mapanalipdan ang bakterya gikan sa pagbalhin sa plasmid ug impeksyon sa phage ug sa ulahi gigamit pag-usab isip usa ka epektibo nga himan sa pag-target sa DNA nga nakabase sa RNA alang sa pag-edit sa genome (Jiang ug Doudna, 2017). Dugang pa, ang sistema sa CRISPR/Cas9 gitaho nga anaa sa 50% ug 87% sa mga genome sa bakterya ug archaeal, matag usa (Ishino et al., 2018). Ang CRISPR/Cas9 usa ka potensyal nga himan alang sa pagtangtang, pagsal-ot ug pagtul-id sa bisan unsang dili normal nga genetic sequence gamit ang in vivo ug in vitro modes (Sabit et al., 2021). Dugang pa, ang CRISPR/Cas9 gipakita nga kabahin sa adaptive immune system tungod sa pagka-espesipiko niini alang sa mga target gene nga interesado (Chen ug Zhang, 2018).
Ang CRISPR/Cas9 gilangkoban sa Cas9 ug usa ka single guide RNA (sgRNA). Ang Cas9 usa ka endonuclease nga gilangkoban sa daghang mga sangkap sa protina. Dugang pa, ang Cas9 adunay talagsaon nga istruktura ug conformational nga mga kabtangan (Pacesa et al., 2022) tungod kay kini gilangkoban sa duha ka lobes: recognition (REC) ug nuclease (NUC). Ang REC lobe gibahin pa sa tulo ka rehiyon: REC1, REC2, ug bridge helices (Cromwell et al., 2018). Ang NUC gilangkoban sa tulo ka lobes, nga mao ang RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH ug ang protospacer adjacent motif (PAM) interaction domain (Fig. 1) (Song et al., 2016). Ang sgRNA gilangkoban sa duha ka sangkap, lakip ang CRISPR RNA (crRNA) ug transcoding small RNA (tracer RNA) (Figure 1). Ang sgRNA nagkonektar sa Cas9 protein ngadto sa connexins aron maporma ang usa ka active complex, nailhan usab nga effector complex (Richter et al., 2012). Ang crRNA usa ka 18–20 nucleotide base pair nga adunay kritikal nga papel sa pag-ila sa target DNA sequences. Dugang pa, ang crRNA nagpares sa target DNA, ug ang tracrRNA nagsilbing scaffold para sa Cas9 nuclease aron ihigot ang target DNA (Manghwar et al., 2019). Sa laing bahin, ang PAM sequence adunay 3 ka nucleotides, nga nagpamatuod, nagtino ug nagpataliwala sa pagbugkos sa effector complex sa DNA. Ang Cas9 protein complex subunits nga RuvC ug HNH adunay catalytic activity (Richter et al., 2012; Asmamaw ug Zawdie, 2021). Ang HNH nuclease domain sa Cas9 subunit nagputol sa DNA strand nga nalangkit sa crRNA. Ang RuvC nuclease domain moputol sa ubang mga strand sa DNA ug makamugna og double-strand breaks (DSBs), human niini duha ka lain-laing mekanismo sa pag-ayo sa DNA break ang ma-activate (Jiang ug Doudna, 2017) (Figure 1).
Hulagway 1. Kinatibuk-ang Pagtan-aw sa CRISPR/Cas9 (A). Mga sangkap sa sistema sa CRISPR/Cas9: (i). Ang Cas9 endonuclease mao ang responsable sa pagputol sa target nga DNA sequence, (ii) usa ka single guide (sg) RNA nga resulta sa paghiusa sa crRNA ug tra-crRNA chimeras. (duha). Ang Cas9 naglakip sa daghang mga sangkap sama sa Rec I, Rec II, NUC lobe (ang HNH ug Ruv C mga subcomponent) ug PAM interaction domain (C) nga adunay katugbang nga mga gimbuhaton. Ang CRISPR/Cas9 protein complex nagbahin sa mga sequence sa DNA ngadto sa dili komplementaryo ug komplementaryong mga porma (D). Ang CRISPR/Cas9 nag-edit sa genome sa tulo ka yugto: pag-ila, pagputol ug pag-ayo. Ang gidisenyo nga sg-RNA naggiya sa Cas9 ug nag-ila sa gitinguha nga sequence pinaagi sa komplementaryong sangkap nga crRNA. Ang Cas9 nag-ila sa PAM sequence sa 5′-NGG-3′ ug nagtunaw sa DNA, nga nagporma og DNA-RNA hybrid ug nag-activate sa cleavage. Ang HNH domain sa Cas9 moputol sa complementary strand, ug ang RuvC domain moputol sa non-complementary strand. Ang CRISPR/Cas9 moayo sa dsDNA pinaagi sa pagbungkag niini sa duha ka paagi: non-homologous end joining (NHEJ) ug homology-directed repair (HDR). Ang NHEJ moayo sa double-stranded DNA kung walay langyaw nga homologous DNA pinaagi sa enzymatic process, usa ka error-prone mechanism nga makasal-ot o makatangtang sa random nga DNA sequences. Ang HDR espesipiko kaayo ug nanginahanglan og homologous DNA templates.
Ang mga agianan sa pag-ayo nga gipaagi sa CRISPR/Cas9 naglakip sa mga mekanismo nga dili homologous end joining (NHEJ) ug homology-directed repair (HDR). Ang NHEJ usa ka agianan nga dali ra masayop tungod kay kini naglambigit sa pagsal-ot o pagtangtang ug wala magkinahanglan og bisan unsang sumbanan atol sa mekanismo sa pag-ayo. Gigamit niini ang random nucleotides aron makamugna og standard nga mga protina (Abbasi et al., 2021). Kini nga sistema sa pag-ayo gilangkoban sa upat ka mga complex sama sa KU complex, ang cross-complementing protein complex type 4 (XRCC-4), ang DNA end processing enzyme, ug ang protein kinase DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). Ang KU complex protein adunay duha ka subunit, ang Ku 70 ug Ku 80, ug adunay importanteng papel sa mekanismo sa NHEJ, tungod kay ang mekanismo sa pag-ayo gisugdan pinaagi sa pagbugkos sa duha ka subunit (Ku 70 ug Ku 80) ngadto sa blunt o hapit blunt nga mga tumoy sa target nga DNA (Abbasi et al., 2021), nga nagsilbing scaffold aron ma-recruit ang ubang mga hinungdan nga may kalabutan sa NHEJ sa lugar sa kadaot (Yang et al., 2020). Ang XRCC-4 ug DNA ligase gilangkoban sa 334 ug 911 nga amino acid, matag usa, ug ang XRCC4-DNA ligase IV complex nagpadasig sa ligation sa mga tumoy sa DNA (Chatterjee et al., 2015). Ang DNA end processing enzyme, nailhan usab nga polynucleotide kinase 3′-phosphate, usa ka DNA end processing enzyme. Mahimo niini nga tangtangon ang 3′P group sa DNA ug i-phosphorylate ang 5′OH group atol sa pag-ayo sa DSB. Naglambigit usab kini sa pag-ayo sa mga single-strand break (SSB) gamit ang SSB repair pathway (Chatterjee et al., 2015). Ang Protein kinase DNA-PKcs usa ka DNA-dependent protein kinase nga gilangkoban sa usa ka catalytic subunit sa PIKKs (phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases) ug ataxia telangiectasia mutated (ATM) family, ingon man ATM ug Rad3-related ATRs. strand breaks (DSBs) ug single-strand breaks (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
Ang HDR usa ka mas tukma ug angay nga mekanismo sa pag-ayo tungod kay ang impormasyon gikopya gamit ang wala mausab nga porma sa homologous DNA duplex, bisan kung nanginahanglan kini sa presensya sa mga sister chromatids. Kini mahitabo sa panahon sa S/G2 nga hugna sa mammalian cell cycle. Ang HDR kasagaran mahitabo sa mga klase sa yeast, apan ang NHEJ kritikal sa mga mammal (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Ang kompleto nga mekanismo sa pag-ayo gipakita sa Figure 1.
Tungod kay ang TNBC gipahinabo sa genetic ug epigenetic abnormalities, ang pagtul-id sa malignant genomic/epigenomic abnormalities gamit ang CRISPR/Cas9 mahimong usa ka makatarunganon nga pamaagi sa pagtambal (Chen et al., 2019). Dugang pa, ang pipila ka mga transcription factor nga nalambigit sa cell-specific transcriptional regulation mahimong magpakita sa talagsaon nga mga kinaiya sa mga selula sa kanser, nga nagsugyot nga ang transcriptional regulation mahimong usa ka maayo kaayo nga pamaagi alang sa pagtambal sa kanser (Drost et al., 2017). Ang pagpahimulos niining mga molekular nga bahin sa mga tumor, sama sa genetic, epigenetic ug transcriptional defects, alang sa pagpalambo sa tambal makapauswag sa mga klinikal nga resulta ug makapakunhod sa mga gasto sa screening. Ang CRISPR usa ka potensyal nga himan sa pag-edit sa gene nga dili lamang makamatikod ug makaila sa mga genomic target nga hinungdan sa kanser, apan magamit usab sa pag-edit, pagpugong, ug pag-usab sa epigenetically sa mga oncogenes sa mga selula sa tawo (Table 1) (Ahmed et al., 2021). Daghang mga CRISPR screen ang gihimo aron mangita sa mga gene nga nalangkit sa mga tumor suppressor, oncogenes, ug resistensya sa tambal. Ang paggamit sa CRISPR/Cas9 aron usbon ang lainlaing mga TNBC oncogenes gipakita sa Figure 2.
Hulagway 2. Pag-edit sa gene sa lain-laing mga TNBC oncogenes gamit ang CRISPR/Cas9 nga miresulta sa pagkunhod sa pagtubo sa tumor ug metastasis. Kini nga mga oncogenes naglakip sa CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 ug CXCR7, Crypto1, ROR1 ug ST8SIA, nga nalambigit sa pagkahitabo ug metastasis sa TNBC.
Ang pagbalhin sa mga selula sa kanser, pagsulong, ug epithelial-mesenchymal transition (EMT) nalangkit sa ITGA9. Ang mga nangaging pagtuon nagpakita nga ang ITGA9 usa ka hinungdanon nga magdudula sa Notch pathway ug adunay makapaikag nga papel sa rhabdomyosarcoma metastasis (Molist et al., 2020). Dugang pa, ang ITGA9 nakit-an nga suod nga nalangkit sa prognosis sa pasyente sa daghang mga tipo sa tumor, lakip ang kanser sa suso (Wang Z. et al., 2019). Dugang pa, ang bioinformatics analysis sa ITGA9 nagpakita nga ang ekspresyon niini sa TNBC labi ka taas kaysa sa ubang mga subtype sa kanser sa suso. Ang taas nga lebel sa ITGA9 nalangkit sa metastasis sa tumor ug pagbalik sa sakit sa mga pasyente sa TNBC. Ang pag-knockout sa ITGA9 pinaagi sa CRISPR/Cas9 miresulta sa mga kabtangan nga sama sa cancer stem cell (CSC), angiogenesis sa tumor, pagtubo sa tumor, ug pagkunhod sa metastasis pinaagi sa pagpasiugda sa pagkadaot sa β-catenin sa TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Ang Crypto-1 usa ka miyembro sa pamilyang TGF-β ug kritikal alang sa sayo nga embryogenesis, pagmentinar sa stem cell, ug metastasis sa kanser (Ishii et al., 2021). Nailhan usab nga Tdgf-1, kini usa ka oncogenic GPI-anchored signaling protein nga nalambigit sa regulasyon sa pagporma sa primitive streak, mesoderm ug endoderm, ingon man ang pagtukod sa wala/tuo nga asymmetry sa paglambo sa mga organo sa lawas atol sa embryogenesis (Zhang et al., 2021b). Dugang pa, ang Cripto-1 gipakita nga nalambigit sa epithelial-mesenchymal transition (EMT) isip stem cell marker (Zhang et al., 2021b). Ang EMT kritikal dili lamang alang sa lainlaing mga proseso sama sa embryonic development, fibrosis ug pag-ayo sa samad, apan alang usab sa pagsulong sa kanser ug metastasis. Dugang pa, ang Cripto-1 gipakita nga nakig-uban sa upat ka Notch receptor ug nagpalambo sa ilang post-translational maturation (Brandstadter ug Maillard, 2019). Ang Notch signaling pathway nailhan nga nalambigit sa pagmentinar sa mga selula sa kanser sa suso sa tawo. Gipakita sa mga pagtuon nga ang CRISPR/Cas9-mediated knockout sa Crypto-1 makapugong sa pagtubo sa kanser ug metastasis. Busa, ang Crypto-1 mahimong usa ka importante nga therapeutic target para sa TNBC (Castro et al., 2015).
Ang XCL12 protein ug ang chemokine receptor niini nga CXC (CXCR4 ug CXCR7) adunay lain-laing papel sa pagdaghan, pagtubo, paglalin, ug pagsulong sa mga selula sa kanser (Wu et al., 2015). Kini nga mga chemoreceptor nalambigit sa pag-uswag sa TNBC pinaagi sa daghang mga signaling pathway sa parehong in vivo ug in vitro nga mga modelo (Wu et al., 2015). Dugang pa, ang pagpaaktibo sa CXCR4 ug CXCR7 nalambigit sa mas dako nga posibilidad sa metastasis ug dili maayo nga prognosis sa TNBC (Karn et al., 2022). Busa, ang pag-knockout sa CXCR4 ug CXCR7 mahimong epektibo nga mga gene sa target sa tambal alang sa pagtambal sa kanser sa suso, lakip ang TNBC. Ang pagtuon ni Yang et al. Yang et al (2019) migamit sa CRISPR/Cas9 aron i-co-knockout ang mga gene sa CXCR4 ug CXCR7 ug nakit-an nga ang pagdaghan, pagtubo, paglalin, ug pagsulong sa TNBC napugngan pag-ayo (Yang et al., 2019).
Naobserbahan ang pagtaas sa lebel sa miR-3662, usa ka TNBC oncogene, sa mga tisyu sa kanser sa suso (Yi et al., 2022). Napamatud-an nga ang pag-knockdown sa miR-3662 makapugong sa pagtubo ug metastasis sa tumor sa kanser sa suso sa in vivo ug in vitro (Agarwal ug Gupta, 2021). Ang HBP-1 usa ka kusgan nga inhibitor sa Wnt/-catenin signaling ug lagmit responsable sa pagtubo sa mga TNBC cells nga gipahinabo sa miR-3662. Bag-ohay lang, nakita ni Yi et al. nga ang miR-3662-HBP1 axis nag-regulate sa Wnt/-catenin signaling pathway sa mga TNBC cells (Yi et al., 2022). Tungod sa tumor-specific expression niini, ang miR-3662 mahimong usa ka potensyal nga therapeutic target para sa TNBC. Busa, ang CRISPR/Cas9-mediated knockdown sa miR-3662 mahimong usa ka maayo kaayo nga pamaagi para sa pagpalambo og bag-ong mga tambal para sa pagtambal sa TNBC.
Ang UBR5 usa ka 300 kDa nucleophosphoprotein nga giila nga usa ka importanteng regulator sa tumorigenesis, metastasis, ug immune response sa nagkalain-laing mga kanser (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Ang UBR5 gitaho nga taas og upregulated sa mga sample sa TNBC ug nagpadasig sa ERα function pinaagi sa pag-induce sa proliferation pinaagi sa ubiquitin ligase activity niini (Bolt et al., 2015). Ang whole exome sequencing studies sa primary TNBC samples nagpakita usab og dugang nga expression sa UBR5, nga nagsugyot sa papel niini sa pag-uswag sa TNBC. Dugang pa, ang CRISPR/Cas9-driven deletion sa UBR5 nagpakita og dakong pagpugong sa TNBC metastasis ug pagtubo sa mga experimental mouse model. Dugang pa, ang paglakip sa UBR5 sa usa ka wild-type mouse model nagpahiuli sa hingpit nga functionality niini, samtang kini nga epekto wala maobserbahan sa inactivated mutant strains (Liao et al., 2017). Ang kakulang sa UBR5 nalangkit sa dugang nga apoptosis, necrosis, ug pagpugong sa pagtubo sa tumor sa TNBC tungod sa dili maayo nga angiogenesis. Tungod sa pagkawala sa UBR5, ang pagkaylap sa tumor ngadto sa lagyong mga organo mikunhod, ug ang UBR5 nag-induce sa abnormal nga EMT pinaagi sa pagkunhod sa ekspresyon sa E-cadherin (Zhang ug Weinberg, 2018). Bag-ohay lang, ang UBR5 gipakita nga usa ka importante kaayo nga hinungdan sa IFN-γ-induced PDL1 transcription sa TNBC tungod sa kakulang niini sa E3 ubiquitination activity. Ang RNA transcriptome analysis nagpadayag nga ang UBR5 mahimong adunay systemic effects sa mga gene nga nalangkit sa IFN-γ pathway ug nagpasiugda sa PDL1 transactivation pinaagi sa pagdugang sa activation levels sa protein kinase RNA (PKR) ug sa mga signal transducers ug activators niini. transcription 1 (STAT1) ug interferon regulatory factor 1 (IRF1). Apan, ang CRISPR/Cas9-mediated combined ablation sa UBR5 ug PD-L1 expression adunay synergistic therapeutic effect kaysa sa blockade lang, nga adunay dakong epekto sa tumor microenvironment (Wu et al., 2022). Busa, ang CRISPR/Cas9 mahimong usa ka importante nga himan aron mapugngan ang function sa UBR5, sa ingon mapugngan ang TNBC metastasis ug pagtubo sa tumor.
Ang ROR1 usa ka type I transmembrane protein nga gi-express atol sa kanser ug embryonic development ug giila nga usa ka oncofetal protein (Nicholas Borcherding, 2014). Ang invasive nga kinaiya sa lain-laing mga kanser sa tawo nalangkit sa upregulation sa ROR1. Maayong mga resulta ang nakuha gikan sa in vivo ug in vitro nga mga pagtuon nga naglambigit sa mga therapeutic compound nga nagtumong sa ROR1 (Chien et al., 2016). Ang taas nga lebel sa ROR1 mRNA sa mga biopsy sa tisyu sa suso nalangkit usab sa agresibo nga basal-like breast (BL) tumor ug ang ilang pagbalhin ngadto sa ubang mga bahin sa lawas. Dugang pa, ang overexpression sa ROR1 giila nga usa ka prognostic marker alang sa pag-uswag sa TNBC (Chien et al., 2016). Bisan pa, ang pagpahilom sa ROR1 gamit ang CRISPR/Cas9 aron mapugngan ang pagtubo ug metastasis sa TNBC mahimong usa ka epektibo nga estratehiya.
Ang proseso sa sialylation naglambigit sa pagdugang sa sialic acid sa glycoconjugates, nga gi-catalyze sa sialyltransferases (STs). Ang ST8SIA1 nahisakop sa pamilyang ST ug adunay importanteng papel sa pathogenesis sa nagkalain-laing mga sakit sama sa lymphocytic leukemia ug colorectal cancer (Chang et al., 2018). Ang RNA sequence analysis nagpakita nga ang ST8SIA1 taas og ekspresyon sa tisyu sa suso sa mga pasyente nga adunay TNBC ug positibo nga nakig-uban sa mga mutasyon sa tumor suppressor gene p53, nga mahimong makatampo sa pathogenesis sa TNBC (Battula et al., 2017). Dugang pa, ang ST8SIA1 nalambigit sa metastasis ug pagbalik sa TNBC, nga nagsugyot nga kini adunay importanteng papel sa pagkahitabo ug pag-uswag sa TNBC. Sa usa ka in vitro model sa TNBC, ang pag-knockdown sa ST8SIA1 sa CRIPSR/Cas9 gipakita nga nakababag sa pagtubo ug metastasis (Battula et al., 2017). Kini nagsugyot nga ang CRISPR/Cas9 mahimong usa ka importante nga himan alang sa pagpugong sa function sa ST8SIA1 oncogene sa pagtambal sa TNBC.
Ang NAT1 usa ka metabolic enzyme nga nag-catalyze sa pagporma sa phase II xenobiotic compounds ug gipahayag sa halos tanang tisyu sa tawo. Ang NAT1 makagamit sa cofactor folate aron i-target ang acetyl-CoA (acetyl-CoA) bisan kung wala ang aromatic amine substrate (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Gipakita sa mga pagtuon nga ang NAT1 nag-regulate sa matrix metalloproteinase 9 (MMP9) function sa mga modelo sa selula sa kanser sa suso ug nanalipod batok sa reactive oxygen species (ROS) atol sa glucose starvation (Wang et al., 2018). Ang pagtangtang sa NAT1 gipakita nga nagpugong sa pyruvate dehydrogenase complex, nga mosangpot sa mitochondrial dysfunction (Wang L. et al., 2019). Dugang pa, lain-laing mga report ang nagpakita nga ang NAT1 inhibition gamit ang gagmay nga mga molekula ug siRNA silencing makapakunhod sa invasiveness ug pagdaghan sa mga selula sa kanser sa suso (Stepp et al., 2018). Bag-ohay lang, gigamit ang CRISPR/Cas9 aron mapugngan ang NAT1 sa linya sa selula sa kanser sa suso nga MDA-MB-231, nga nakaapekto sa metabolismo sa selula depende sa lebel sa ekspresyon niini. Gipakita usab niini nga pagtuon nga ang NAT-1 kritikal alang sa pag-uswag ug metastasis sa TNBC (Carlisle et al., 2020).
Ang koordinado nga transkripsyon sa mga oncogene gi-regulate sa mga super enhancer, transcription factor ug cofactor (Hnisz et al., 2015). Dugang pa, ang usa ka grupo sa mga cyclin-dependent kinases (CDK), sama sa CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, ug CDK13, gikinahanglan alang sa regulasyon sa transkripsyon. Lakip niini, ang CDK7 nalambigit sa phosphorylation sa RNA polymerase II, nga importante kaayo alang sa pagsugod ug pagpalapad sa oncogene transcription sa pathogenesis sa TNBC. Sa usa ka hinungdanon nga pagtuon, ang pagtangtang sa CDK7 sa CRISPR/Cas9 nagpugong sa TNBC, nga nagpakita nga ang pathogenesis sa TNBC nagdepende sa CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Gipakita sa mga pagtuon nga ang mga mutasyon sa MYC ug RBP (RNA binding protein) mahimong mosangpot sa apoptosis, samtang ang single gene mutations sa MYC o RBP wala makaapekto sa pagtubo sa mga selula sa kanser (Einstein et al., 2021). Kapin sa 1000 ka RBP sa genome sa tawo ang gisusi gamit ang CRISPR/Cas9-based library. Lakip niini, 57 ka RBP ang nakit-an nga kritikal alang sa pagtubo sa mga selula sa kanser nga adunay taas nga lebel sa MYC (Wheeler et al., 2020). Dugang pa, ang YTHDF2 importante alang sa pagmintinar sa pagtubo sa selula sa TNBC ug nagpamenos sa gidaghanon sa methylated transcripts atol sa taas nga lebel sa transcription ug translation sa mga selula sa kanser nga adunay mas taas nga ekspresyon sa MYC. Dugang pa, ang YTHDF2 dili hinungdanon alang sa mga selula sa kanser, nga dili kaayo nagsalig sa taas nga lebel sa MYC aron mapalugway ang survival sa mga pasyente sa TNBC (Einstein et al., 2021), nga nagsugyot nga kini mahimong usa ka potensyal nga therapeutic target alang sa mga tambal nga makabuntog sa TNBC.
Ang mga zinc finger protein (ZNF) naglangkob sa gibana-bana nga 1% sa kinatibuk-ang genome sa tawo. Gipakita sa mga pagtuon nga ang ZNF maka-regulate sa pagdaghan sa selula sa lainlaing mga kanser, sama sa kanser sa atay, kanser sa suso ug kanser sa colorectal (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Ang mga librarya nga gihimo sa CRISPR knockout gigamit aron masusi ang lainlaing mga tumor suppressor gene (TSG) sa mga selula sa kanser sa suso (Shalem et al., 2014). Sukad niadto, usa ka transcriptomic nga pagtuon sa mga selula sa kanser sa suso nga natangtang sa CRISPR/Cas9 ZNF319 nagpakita nga ang ZNF319 usa ka tumor suppressor gene nga nagpamenos sa pagdaghan sa kanser sa suso ug busa nalambigit sa lainlaing mga potensyal nga mekanismo sa pagsenyas ug uban pang mga gimbuhaton sa biyolohikal (Wang L. et al., 2022).
Ang Ferroptosis usa ka klase sa programmed cell death nga nagsalig sa presensya sa iron. Nahibal-an nga ang pag-uswag sa ferroptosis naimpluwensyahan sa presensya sa lipid peroxides. Dugang pa, ang PKCβII gitaho nga nagpakita sa sayo nga lipid peroxidation, ug ang pagtaas sa lipid peroxidation nalangkit sa ferroptosis. Ang pag-screen sa usa ka librarya sa CRISPR/Cas9-mediated kinase inhibitors nagpadayag nga ang PKCβII nalambigit sa proseso sa lipid peroxidation, nga kritikal alang sa ferroptosis sa MDA-MB-231 cells (Zhang et al., 2022). Busa, kini nagsugyot nga ang knockout sa PKCβII sa CRISPR/Cas9 mahimong usa ka potensyal nga target sa tumor suppressor gene alang sa pagtambal sa mga sakit nga may kalabutan sa ferroptosis (Zhang et al., 2022).
Ang resistensya sa tambal gituohan nga responsable sa gibana-bana nga 90% sa mga kamatayon sa mga pasyente sa kanser ug usa sa mga nag-unang hagit sa pagtambal sa kanser (Bukowski et al., 2020). Ang mga resulta nagpakita nga ang igo nga gidaghanon sa mga gene nga may kalabotan sa pag-agas sa tambal, pag-ayo sa DNA, apoptosis ug lainlaing mga agianan sa senyas sa selula nalangkit sa resistensya sa tambal (Haider et al., 2020). Lakip niini, daghang mga gene ang gitarget sa mga himan sa CRISPR/Cas9 ug nagpakita og maayong mga resulta sa pagpakunhod sa resistensya sa tambal ug pagdugang sa kaepektibo sa mga pagtambal batok sa kanser (Vaghari-Tabari et al., 2022). Dugang pa, ang mga high-throughput nga CRISPR/Cas9 gene knockout screening libraries nalambigit sa pag-usab sa function sa mga potensyal nga target sa gene nga resistensya sa tambal (Shalem et al., 2015). Aron mailhan ang mga gene nga resistensya sa paclitaxel, ang RNA sequencing inubanan sa genome-wide sgRNA library screening gigamit aron mailhan ang walo ka kandidato nga gene, lakip ang histone deacetylase 9 (HDAC9), nga nalangkit sa resistensya sa tambal sa mga pasyente nga adunay balik-balik nga TNBC (B et al., 2020). Sa laing pagtuon, ang pagtaas sa ekspresyon sa diserine/threonine ug tyrosine protein kinase (DSTYK) naobserbahan atol sa pagkabuhi sa mga pasyente sa TNBC nga gitambalan sa mga tambal nga anticancer. Dugang pa, ang CRISPR/Cas9-mediated knockdown sa DSTYK mipausbaw pag-ayo sa apoptosis sa mga selula sa kanser nga resistensya sa tambal in vitro (SUM102PT cells ug MDA-MB-468 cells) ug usa ka in vivo TNBC model (Ogbu et al., 2021).
Bisan tuod ang TNBC adunay abnormal nga pagpaaktibo sa MAPK pathway, ang klinikal nga epekto sa MEK-targeted therapies dili maayo. Usa ka CRISPR/Cas9 genomic library screen nagpadayag nga ang pagpugong sa PSMG2 (proteome assembly chaperone 2) nagpasensitibo sa mga selula sa TNBC BT549 ug MB468 ngadto sa MEK inhibitor AZD6244. Ang CRISPR/Cas9 knockdown sa PSMG2 nakausab sa normal nga function sa proteasome, nga misangpot sa autophagy-mediated disassembly sa PDPK1, sa ingon nagpauswag pa sa mga selula sa tumor sa mga modelo sa ilaga sa TNBC nga gipahinabo sa AZD6244 (MEK inhibitor) ug MG132 (proteasome inhibitor). Busa, ang proteasome ug MAP kinase (MEK) inhibitors mahimong ipanghatag nga synergistically aron makunhuran ang pagdaghan sa mga selula sa tumor (Wang X. et al., 2022).
Ang CRISPR/Cas9 gigamit usab sa pag-screen sa pagkawala sa gene function nga mosangpot sa resistensya sa TNBC (Shu et al., 2020). Gipasabot nila ni Ge et al ang mekanismo sa resistensya sa tambal sa mga selula sa kanser nga gitambalan og JQ1, usa ka BET bromodomain inhibitor (BBDI), sa TNBC. Gamit ang CRISPR/Cas9, ilang nakita nga ang pagtangtang sa rb1 gene hinungdan nga ang TNBC mahimong resistensyado sa tambal nga kontra-kanser nga JQ1. Busa, ang rb1 function importante sa tubag sa mga tambal nga JQ1 sa TNBC. Gireport usab nila nga ang paclitaxel usa ka CDK4/6 kinase/microtubule inhibitor, ug ang kombinasyon niini sa mga BBDI sama sa JQ1 mahimong makahatag og maayong mga tubag sa pagtambal sa TNBC nga resistensya sa tambal (Ge et al., 2020).
Ang transcriptional landscape sa long noncoding RNA (lncRNA) gitaho nga responsable sa resistensya sa neoadjuvant therapy sa TNBC. Kini nga pagtuon nagpakita nga lima ka lain-laing MALAT1 lncRNA transcripts ang taas nga gipahayag sa TNBC. Dugang pa, ang CRISPR/Cas9-mediated deletion sa MALAT1 nagdugang sa pagkasensitibo sa mga TNBC BT-549 cells sa paclitaxel ug doxorubicin, nga nagsugyot sa usa ka potensyal nga papel alang sa resistensya sa MALAT1 sa TNBC (Shaath et al., 2021).
Ang mga mutasyon sa BRCA1 (BRCA1m) lainlain ug busa lisod mamatikdan. Ang pag-target sa PARP1 (poly(ADP-ribose) polymerase), ang synthetic lethal partner sa BRCA1, mahimong makadugang sa TNBC drug chemosensitivity. Gamit ang CRISPR/Cas9, ang pagtangtang sa PARP1 nagdugang sa pagkasensitibo sa mga tambal nga anticancer sama sa doxorubicin, gemcitabine ug docetaxel sa mBRCA1 mutant TNBC cells, nga nagsugyot nga ang PARP1 nalambigit usab sa resistensya sa tambal sa TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Ang mga mutasyon sa tumor suppressor genes nga BRCA1 o BRCA2 nailhan nga nagdugang sa posibilidad nga maugmad ang kanser sa suso sa mga tawo. Ang pagtambal niini nga mga pasyente nanginahanglan sa paggamit sa mga PARP inhibitor. Dugang pa, napamatud-an nga ang knockout sa nucleotide salvage factor DNPH1 gamit ang CRISPR/Cas9 makatangtang sa makahilong nucleotide 5-hydroxymethyldeoxyuridine (hmdU) monophosphate, sa ingon nagpalambo sa tubag sa mga selula nga kulang sa BRCA sa pagkasensitibo sa mga PARP inhibitor (Fugger). et al., 2021). Busa, ang CRISPR/Cas9 ug PARP1 inhibitors mahimong usa ka importante nga estratehiya sa pagtambal alang sa TNBC.
Ang penetrant glycoprotein (P-gp) gene usa ka multidrug resistance gene nga kasagarang mo-upregulate sa gibana-bana nga 41% sa tanang TNBC (Sun et al., 2020). Ang P-gp-induced drug efflux giila nga usa ka importanteng regulator sa drug resistance sa kanser sa suso. Ang mga P-gp inhibitor nagpakita og dugang nga sensitivity sa mga tambal nga anticancer sa kanser sa suso (Famta et al., 2021). Busa, ang CRISPR/Cas9-mediated ablation o pagsumpo sa P-gp ug P-gp inhibitors mahimong importante kaayo nga mga pamaagi aron mabuntog ang drug resistance sa TNBC.
Ang ATP-binding cassette transporter G2 (ABCG2) nailhan nga hinungdan sa drug resistance sa TNBC (Palasuberniam et al., 2015), bisan kung wala pa'y mga report sa pagkakaron bahin sa relasyon tali sa CRISPR/Cas9 ug ABCG2 silencing ug tumor suppressor gene inactivation. Ang PTEN mahimong mopausbaw sa ABCG2 activation (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Busa, ang paggamit sa CRISP/Ca9 aron makuha ang ABCG2 ug ang paghiusa niini sa usa ka ABCG2 inhibitor mahimong usa ka angay nga pagtambal aron mabuntog ang drug resistance sa TNBC. Ang Talaan 2 naghisgot sa CRISPR/Cas9 nga nagtumong sa tanang resistance genes.
Talaan 2. Ang CRISPR/Cas9 nagtumong sa lain-laing mga gene nga resistensya sa TNBC aron mahimong sensitibo ang mga selula sa mga tambal nga kontra-kanser.
Ang mga librarya sa CRISPR/Cas9 mga potensyal nga himan alang sa pag-screen sa mga mutasyon sa gene nga nalangkit sa pathogenesis sa kanser (Chan et al., 2022). Kini nga pamaagi sa screening naglakip sa upat ka mga lakang sama sa (a) pagtukod og librarya, (b) lentiviral transduction, (c) phenotypic screening, ug (d) target gene analysis. Bisan kung ang TNBC adunay abnormal nga pagpaaktibo sa MAPK pathway, ang klinikal nga prognosis sa MEK targeted therapy alang sa mga pasyente sa TNBC nga adunay mga mutasyon sa mga tumor suppressor gene sama sa PTEN, RB1, ug TP53 dili maayo kaayo.
Dugang pa, usa ka gene knockout screen gamit ang CRISPR/Cas9 ang nagsulay sa labing kusgan ug mapili nga molekula, ang dehydrocatrol, nga daghan sa mga extract sa bulak ug dahon sa Guatemala, aron masabtan ang epekto sa dehydrocatrol sa MDA-MB-231. Mga mekanismo sa selective cell cytotoxicity. Mga kinaiya sa mesenchymal stemness sa mga TNBC subtypes. Kini nga CRISPR/Cas9-based screen nagpadayag usab nga ang HSD17B11, usa ka gene nga nag-encode sa 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 11, taas nga gipahayag sa mga selula sa MDA-MB-231 ug miresulta sa dehydrofalcarinol nga espesipiko alang sa mga selula sa MDA-MB-231 (Grant et. al., 2020). Busa, kini nagsugyot nga ang CRISPR/Cas9 genomic screening adunay dako nga potensyal sa pag-ila sa mga mekanismo nga nagpahiping mga kabtangan sa anticancer sa potensyal nga natural nga mga compound.
Dugang pa, ang kahuyang sa TNBC sa kanser gitun-an gamit ang usa ka walay gidapigan nga genome-wide in vivo CRISPR/Cas9 screen, nga nagpakita sa usa ka sumpay tali sa oncogenic ug tumor suppressor pathways. Ang mga nag-unang sangkap sa mTOR ug Hippo pathways gitaho nga adunay hinungdanon nga papel sa regulasyon sa tumor sa TNBC. Dugang pa, ang mga pagtuon nagpakita nga ang pharmacological inhibition sa mTORC1/2 ug YAP oncoprotein epektibo nga nagpugong sa pathogenicity sa TNBC gamit ang usa ka in vitro drug-matrix synergy model ug in vivo patient-derived xenografts. Dugang pa, ang Torin-1-mediated mTORC1/2 inhibition nagpalambo sa macropinocytosis, samtang ang verteporfin-induced YAP inhibition mosangpot sa kamatayon sa TNBC cell. Kung tan-awon sa kinatibuk-an, kini nga mga resulta nagpasiugda sa gahum ug kalig-on sa genome-wide in vivo CRISPR screening aron mailhan ang bag-o ug epektibo nga mga pagtambal alang sa TNBC (Dai et al., 2021).
Ang pagkadaot sa sistema sa imyunidad usa ka importante nga butang sa tumorigenesis. Ang mga selula sa kanser makalikay sa immune clearance pinaagi sa paglaktaw sa mga mekanismo sa depensa, lakip ang pagpanghilabot sa kalihokan sa mga selula sa imyunidad sa tumor microenvironment ug pagkompromiso sa sistema sa imyunidad. Busa, ang pagpalambo sa usa ka gipauswag nga sistema sa imyunidad mahimong usa ka hinungdanon nga pamaagi sa pagpakigbatok sa mga tumor. Ang paggamit sa CRISPR/Cas9-based gene modification nagtubag sa daghang mga isyu nga may kalabotan sa immune dysfunction gikan sa lainlaing mga panan-aw. Ang CRISPR/Cas9 gigamit aron mapaayo ang resistensya sa antitumor batok sa kanser sa suso pinaagi sa mosunod nga mga agianan (Figure 3).
Hulagway 3. Ang immunotherapy sa CRISPR/Cas9 nagtumong sa mga TNBC cells. Ang pagkawala sa CDK5 ug ang pag-knockdown sa PDL1 ug CD155 nagpalig-on sa immune system. Ingon man usab, ang pagkawala sa A2AR ug ang pag-knockdown sa mga TAA sama sa HER2, mucin 1 ug TEM8 nagdugang sa kahusayan sa mga CAR-T cells sa pagpatay sa mga cancer cells. Ang CRISPR/Cas9-driven T cell screening nagpakita nga ang pagkabalda sa p38 kinase nagpalambo sa kalihokan sa antitumor sa T cell. Ang mga T cell nga giusab sa CRISPR/Cas9 nagdugang sa ekspresyon sa TCR (T cell receptor), nga miresulta sa mga T cell nga adunay kalihokan sa antitumor.
Ang tumong sa immunotherapy mao ang pag-aghat sa immune system sa pag-atake sa mga selula sa kanser. Ang sobra nga pag-expression sa mga immune checkpoint protein kasagaran makapugong sa mga autoimmune reaction apan makatabang sa mga kanser nga malikayan kini (Topalian et al., 2015). Kini nga mga protina makapugong sa mga immune reaction pinaagi sa pagbugkos sa mga receptor sa ibabaw sa mga immune cell. Daghang checkpoint protein (sama sa CD155 ug PD-L1) ang nag-target sa PD-1 receptor sa mga immune cell ug gipahayag sa kanser sa suso, labi na ang TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). Ang pag-knockdown sa PD-L1 o sa receptor niini gamit ang CRISPR/Cas9 mahimong makapukaw sa immune system sa pag-atake sa mga tumor sa TNBC (Yahata et al., 2019). Dugang pa, ang downregulation sa PD-L1 expression pinaagi sa CRISPR/Cas9-mediated deletion sa CDK5 gipakita nga makapugong sa pagtubo sa tumor in vitro ug in vivo (Deng et al., 2020). Ang pagpugong sa pagtubo sa in vitro ug in vivo nga mga modelo sa kanser sa suso nagsugyot nga ang pagkunhod sa CD155 nga gipaagi sa shRNA mahimong adunay epekto sa pagtambal sa kanser sa suso (Gao et al., 2018).
Ang mga CAR T cell nagpahayag sa mga CAR nga makaila sa mga tumor-associated antigens (TAAs) ug makagamit sa knockdown sa mga checkpoint protein aron mapalambo ang ilang kalihokan (Li C. et al., 2020). Adunay lain-laing mga potensyal nga target alang sa CAR T cell therapy sa kanser sa suso, lakip ang daghang mga TAA sama sa HER2, mucin1, ug TEM8 (Bajgain et al., 2018). Adunay ebidensya nga ang mga CAR T cell nga nagtumong sa mesothelin (overexpressed sa mga TNBC BT-459 cells) mas epektibo batok sa kanser kung ang PD-1 ma-knockout gamit ang CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Bisan pa, ang pag-isolate sa mga T cell gikan sa mga pasyente ug dayon pag-edit niini ex vivo usa ka proseso nga nagkinahanglan og daghang trabaho ug oras. Bisan kung ang universal T cells makapakunhod sa mga kinahanglanon sa isolation, ang mga donor T cell nga nagpahayag sa human leukocyte antigen (HLA) class I ug T cell receptor (TCR) kinahanglan nga tangtangon aron malikayan ang mga abnormalidad sa graft-versus-host (Ren et al., 2017). , 2017a). Gamit ang CRISPR/Cas9, ang HDR dungan nga makatangtang sa TCR ug HLA ug makatangtang sa gene nga nag-encode sa CAR. Gipakita sa mga pagtuon nga ang CRISPR/Cas9 magamit sa pagpaila sa mga anti-CD19 CAR ngadto sa TCR locus, sa ingon episyente nga paghimo og mga CAR nga dili mahurot ang mga T cell (Dimitri et al., 2022). Ang mga teknolohiya sa multiplex naugmad aron makamugna og allogeneic CAR T cells pinaagi sa dungan nga pagtangtang sa TCR, beta-2-microglobulin (B2M), HLA-I subunit ug uban pang mga protina sama sa PD-1 ug CTLA-4, nga mahimong adunay mas dako nga anti-cancer properties batok sa TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Ang paggamit sa CRISPR/Cas9 makapauswag sa kaepektibo sa mga CAR-T cells. Ang adenosine nailhan nga adunay mga immunosuppressive nga kabtangan ug makapakunhod sa anticancer immunity pinaagi sa pag-block sa function sa T cell ug pag-activate sa adenosine A2A receptors (A2AR) (Vigano et al., 2019). Ang pagpahilom sa A2AR gamit ang CRISPR/Cas9 nakapauswag pag-ayo sa kaepektibo sa mga CAR-T cells in vivo (Giuffrida et al., 2021). Ang mga T cell nailhan nga nagpakita sa lainlaing mga phenotypic nga kinaiya sama sa cellular expansion, differentiation, oxidative stress ug genomic stress. Ang CRISPR/Cas9-based T cell screening nagpadayag sa pagkabalda sa 25 ka lainlaing mga T cell receptor kinases. Lakip niini, ang pagtangtang sa p38 kinase gipakita nga nagpalambo sa antitumor nga kalihokan sa mga T cells, nga nagpakita nga ang p38 kinase usa ka hinungdanon nga regulator sa regulasyon sa CAR-T cell (Gurasamy et al., 2020).
Ang mga T cell mahimong ma-genetically modified gamit ang CRISPR/Cas9 aron makahimo og taas nga expressed TCRs. Ang pagbalhin sa genetically modified T cells ngadto sa mga pasyente nagpakita og mas kusog nga anticancer activity kay sa endogenous T cells. Busa, ang endogenous TCRs mahimong makigkompetensya sa genetically altered TCRs sa mga pasyente, nga mahimong makaapekto sa potensyal sa cancer immunotherapy. Aron masulbad kini nga problema, ang paggamit sa CRISPR/Cas9 aron makuha ang endogenous TCR-β sa mga recipient cells ug dayon ibalhin ang TCR-β T cells ngadto sa mga pasyente sa kanser mahimong magpakita og mas maayo nga anti-cancer immune responses nga dili kinahanglan ang endogenous TCR sexual competition (Fan et al. 2018). Busa, gawas sa CRISPR-modified T cells, ang TCRs usa ka libo ka pilo nga mas sensitibo sa tumor antigens kay sa normal nga TCR-transduced T cells. Dugang pa, sa lain-laing mga leukemias, ang altered T cells nga namugna sa γδ TCR+ CRISPR nagpakita og mas taas nga expression sa CD4+ ug CD8+ T cells kay sa standard TCR transfer (Legut et al., 2018). Busa, ang giusab nga mga T cell nga namugna sa CRISPR/Cas9 mahimong usa ka epektibo nga pamaagi sa immunotherapy aron mabuntog ang TNBC.
Ang mga integrin mga molekula sa pagdikit sa selula nga anaa sa mga cellular transmembrane ug nagpasiugda sa pagbugkos sa mga selula sa extracellular matrix (ECM) (Hamidi ug Ivaska, 2018). Ang dysregulation sa mga integrin nalangkit sa paglambo ug pagbalhin sa kanser pinaagi sa pag-usab sa extracellular matrix, nga mosangpot sa pagkabuhi sa mga selula sa kanser sa sirkulasyon (Hamidi ug Ivaska, 2018). Ang CRISPR/Cas9-mediated integrin knockdown makapahinay sa pag-uswag sa tumor, metastasis, ug kolonisasyon sa TNBC. Ang knockdown sa integrin a5 (ITGA5) gitaho nga nagpamenos sa pagbalhin ug pag-uswag sa selula sa ubang mga kanser sama sa kanser sa baga (Ju et al., 2017), nga nagsugyot nga ang integrin a5 mahimo usab nga usa ka hinungdanon nga hinungdan sa pathogenesis sa TNBC.
Ang pagmugna og knockout nga mga ilaga gamit ang tradisyonal nga embryonic stem (ES) cell nga mga pamaagi usa ka proseso nga nagkinahanglan og daghang trabaho, panahon, ug dili episyente. Mokabat og mga bulan ug mga tuig aron ma-target ang mga ES cell pinaagi sa homologous recombination, ipanganak ang mga chimeric nga ilaga, ug dayon i-cross kini sa mga heterozygous nga ilaga aron makahimo og homozygous nga mga anak. Gikinahanglan ang komplikado nga crossbreeding aron makahimo og mga ilaga nga adunay daghang genetic mutations. Bisan pa, daghang mga problema ang mitumaw kung mogamit og mga ilaga nga gihimo pinaagi sa ablation sa mga ES cell gamit ang CRISPR/Cas9 o pinaagi sa microinjecting sa mga sangkap sa CRISPR/Cas9 ngadto sa single-cell fertilized nga mga itlog. Pananglitan, ang pagpaila sa mga pagbag-o kanunay nga mahitabo sa biallelic loci ug dili gene specific. Bag-ohay lang gitaho nga ang mga ES cell nga naggamit sa teknolohiya sa CRISPR/Cas9 dungan nga maka-insert og biallelic mutations sa hangtod sa 5 ka gene (Nishizono et al., 2021). Alang niini nga katuyoan, ang Cas9 mRNA ug lima ka gene-specific gRNAs dungan nga gi-transfect ngadto sa mga ES cell. Kini nagpasiugda sa saad ug kaepektibo niini nga pamaagi, bisan kung kini nga mga mutasyon mahimong gipasa sa dihang ang mga founder lines gipasanay aron makahimo og quintuple knockout nga mga ilaga. Ang pagtuon nagtaho usab og usa ka makapakurat nga nadiskobrehan: Ang mga ES cell dili na kinahanglan aron makahimo og genetically modified nga mga ilaga. Hinuon, aron makuha ang piho nga mga produkto sa gene, ang Cas9 mRNA ug gRNA gi-inject sa mga single-cell stage embryo. Ingon usa ka sangputanan, ang mga knockout founder lines nahimo nga magamit sa teorya aron tun-an ang mga sangputanan sa pagtangtang sa gene sa mga ilaga (Qin et al., 2016). Busa, ang CRISPR/Cas9 nagtugot sa paghimo og mga transgenic nga ilaga aron matambalan ang TNBC sa mas ubos nga gasto kaysa tradisyonal nga genetic engineering. Gamit ang CRISPR/Cas system, usa ka bag-ong knockout mouse model ang naugmad nga malampuson nga makapaila sa mga point mutation sa usa o daghan pang endogenous genes sa TNBC. Base niini nga konsepto, ang mga modelo sa hayop sa TNBC mahimo usab nga mapalambo gamit ang CRISPR/Cas9-mediated deletion sa BRCA1 ug p53, nga moresulta sa pagkawala sa pag-ayo sa HR, genomic instability, ug mutant phenotypes (Annunziato et al., 2020).
Sa pagkakaron, lain-laing mga pamaagi sama sa mammography, magnetic resonance imaging (MRI) ug ultrasound ang gigamit sa pagdayagnos sa TNBC. Apan, kini nga mga pamaagi adunay pipila ka mga limitasyon. Ang mammography gigamit sa pagdayagnos sa lokal nga tisyu sa suso imbes nga metastases, diin ang mga selula sa kanser mibalhin ngadto sa ubang mga organo. Ang Ultrasonography dili usa ka kasaligan nga pamaagi sa pagdayagnos sa TNBC (Chen ug Lee-Felker, 2023). Ang MRI adunay mas taas nga sensitivity kay sa ultrasound ug mammography, apan ang diagnostic accuracy niini limitado (Sha ug Chen, 2022). Ang tissue biopsy usa ka invasive nga paagi sa pag-ila sa mga selula sa kanser. Apan, sa pipila ka mga kaso, ang biopsy mahimong dili makakita sa kanser nga tisyu kung ang dagom mopalayo sa lugar nga gikonsiderar. Dugang pa, kini mahal kaayo ug mahimong traumatiko alang sa pasyente. Ang TNBC usa ka heterogeneous nga klase sa kanser, busa ang biopsy mahimong dili makahatag og igong impormasyon bahin sa klase sa kanser. Busa, usa ka bag-o ug kasaligan nga pamaagi sa pagdayagnos alang sa pag-detect sa TNBC ang gikinahanglan dayon. Ang CRISPR/Cas9 mahimong magsilbing usa ka sensitibo kaayo ug minimally invasive nga alternatibo alang sa pagdayagnos sa kanser sa suso. Tungod niini, ang mga estratehiya nga gibase sa CRISPR/Cas9 mahimong gamiton aron mapaayo ang mga pamaagi sa PCR alang sa pagdayagnos sa TNBC. Una, ang mga protina sa Cas9 ug cpf1 sa sistema sa CRISPR gigamit aron makuha ang dili espesipikong DNA, ug dayon kini nga duha ka protina (Cas9 ug cpf1) makaila sa PAM sequence sa dili pa motapot sa target nga DNA (Deepak Singh et al., 2021). Busa, ang PCR makaila sa mga mutasyon nga nalangkit sa paglambo sa kanser. Daghang mga pagtuon ang nagsagop niining estratehiya nga gibase sa CRISPR aron makit-an ang lainlaing mga mutasyon sa lainlaing mga kanser (Safari et al., 2019). Busa, ang mga pamaagi sa PCR nga nakabase sa CRISPR mahimong makapakunhod sa pagsalig sa pagdayagnos sa TNBC sa mga invasive nga pamaagi sama sa biopsy-based immunohistochemistry.
Ang mga pagbag-o sa genotypic sa regulasyon sa hormone receptor napamatud-an usab sa TNBC (Chen ug Russo, 2009). Ang mga estratehiya sa CRISPR/Cas9-based PCR nga naggamit og microarrays para sa point-of-care diagnostics epektibong makamonitor niining mga mutasyon (Hajian et al., 2019). Mahimo usab kini makahatag sa mga healthcare providers og may kalabutan nga impormasyon bahin sa piho nga mga mutasyon sa mga pasyente sa TNBC, nga makatabang sa pagpaayo sa ilang kurso sa pagtambal. Bisan pa, kini nga hiniusa nga teknik adunay mga limitasyon. Busa, gikinahanglan ang halapad nga paningkamot sa panukiduki sa dili pa magamit kini nga pamaagi sa CRISPR/Cas-PCR sa healthcare para sa pagdayagnos sa TNBC (Yang et al., 2019).
Oras sa pag-post: Oktubre 14, 2024